Un modelo de roedor isquémico de pericardio intacto
Summary
Este protocolo describe los pasos para inducir el infarto de miocardio en ratones mientras se preserva el pericardio y su contenido.
Abstract
Este protocolo ha demostrado que el pericardio y su contenido juegan un papel antifibrótico esencial en el modelo de roedor isquémico (ligadura coronaria para inducir lesión miocárdica). La mayoría de los modelos preclínicos de infarto de miocardio requieren la interrupción de la integridad pericárdica con pérdida del medio celular homeostático. Sin embargo, recientemente hemos desarrollado una metodología para inducir el infarto de miocardio, que minimiza el daño pericárdico y retiene la población de células inmunes residentes del corazón. Se ha observado una mejor recuperación funcional cardíaca en ratones con un espacio pericárdico intacto después de la ligadura coronaria. Este método proporciona una oportunidad para estudiar las respuestas inflamatorias en el espacio pericárdico después del infarto de miocardio. El desarrollo adicional de las técnicas de etiquetado se puede combinar con este modelo para comprender el destino y la función de las células inmunes pericárdicas en la regulación de los mecanismos inflamatorios que impulsan la remodelación en el corazón, incluida la fibrosis.
Introduction
Hasta el día de hoy, la enfermedad cardiovascular (ECV) es reconocida como la principal causa de muerte a nivel mundial, lo que resulta en una carga financiera significativa y una reducción en la calidad de vida del paciente1. La enfermedad arterial coronaria (EAC) es un subtipo de ECV y desempeña un papel esencial en el desarrollo del infarto de miocardio (IM), que es un contribuyente principal a la mortalidad. Por definición, el IM resulta de una lesión irreversible en el tejido miocárdico debido a condiciones prolongadas de isquemia e hipoxia. El tejido miocárdico carece de capacidad de regeneración, por lo que las lesiones son permanentes y resultan en el reemplazo del músculo cardíaco con una cicatriz fibrótica que puede ser inicialmente protectora, pero que finalmente contribuye a la remodelación cardíaca adversa y eventual insuficiencia cardíaca2.
Aunque el tratamiento de los pacientes con EAC ha mejorado drásticamente en las últimas décadas, la insuficiencia cardíaca crónica (ICC) secundaria a la isquemia afecta a muchos pacientes en todo el mundo. Para prevenir y manejar esta epidemia, es necesario comprender los mecanismos subyacentes más ampliamente y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. Además, los hallazgos anteriores destacan las limitaciones de la terapia sistémica y la necesidad de desarrollar alternativas precisas. Dado que la investigación de las secuelas moleculares del IM en humanos se ve afectada por la capacidad de acceder al tejido infartado, los modelos animales que recapitulan las características y el desarrollo del IM humano y la ICC relacionados con la ECV son indispensables.
Como los modelos animales ideales se parecen mucho a un trastorno humano por sus características estructurales y funcionales, la etiología de la enfermedad debe guiar su concepción. En la EAC, es la estenosis aterosclerótica crónica de las arterias coronarias u oclusión trombótica aguda. Se han desarrollado y aplicado diferentes métodos en varias especies de animales de laboratorio para inducir el estrechamiento u oclusión de la arteria coronaria. Tales estrategias se pueden clasificar ampliamente en dos grupos: (1) manipulación mecánica de una arteria coronaria para inducir un IM y (2) aterosclerosis acelerada para facilitar el estrechamiento coronario que conduce a un IM. La primera estrategia generalmente implica la ligadura de una arteria coronaria o la colocación de un stent dentro de la arteria. El segundo enfoque tiende a depender de la modificación de la dieta del animal para incluir alimentos altos en grasa / colesterol. Algunas de las limitaciones de este último enfoque incluyen la falta de control sobre el momento y el sitio de las oclusiones coronarias.
Por el contrario, la inducción quirúrgica de IM o isquemia en un modelo animal tiene varias ventajas, como la ubicación, el momento preciso y la extensión del evento coronario, lo que lleva a resultados más reproducibles. El método más utilizado es la ligadura quirúrgica de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Tales modelos recapitulan las respuestas humanas a la lesión isquémica aguda, así como la progresión a CHF3. Inicialmente desarrollada en animales más grandes, la cirugía LAD en animales pequeños como roedores se ha vuelto más factible con los avances en la tecnología4. Al establecer tales modelos, los ratones han sido favorecidos por varias razones, incluida su disponibilidad relativa, bajo costo en vivienda y su capacidad de manipulación genética.
Los modelos quirúrgicos contemporáneos de cardiopatía isquémica que utilizan la oclusión LAD requieren que el investigador abra el pericardio para ligar temporal o permanentemente la arteria5. Tales estrategias resultan en la interrupción del espacio pericárdico, que desempeña una función esencialmente mecánica y lubricante para garantizar una función cardíaca adecuada. Otra desventaja de abrir el pericardio es perder el líquido pericárdico nativo del animal con sus diversos componentes celulares y proteicos 6,7. En respuesta, desarrollamos un método para inducir IM mientras mantenemos intacto el pericardio. Además de minimizar la perturbación de este entorno homeostático, este enfoque permite etiquetar y rastrear células específicas después de causar un IM. Además, este enfoque representa mejor la lesión isquémica miocárdica en el entorno humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inducir un IM en un pericardio cerrado en roedores es único y puede tener aplicaciones potencialmente significativas. El procedimiento depende en gran medida de la familiaridad del cirujano con el modelo de roedor y la anatomía cardíaca del roedor. El éxito también depende de la atención brindada durante tres pasos críticos: incisión del músculo intercostal y retracción de las costillas (Pasos 1.11-1.13), creación del infarto (Paso 1.17) y recuperación animal (Pasos 1.22-1.24).
La …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture – CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture – PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture – BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
Riferimenti
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