Summary
Этот протокол направлен на описание новой методологии измерения внутренней скорости сердечного возбуждения с использованием микроэлектродной записи всей ткани синоатриального узла для выявления дефектов кардиостимуляции у мышей. Фармакологические агенты также могут быть введены в этот метод для изучения их влияния на внутреннее кардиостимуляторы.
Abstract
Синоатриальный узел (САН), расположенный в правом предсердии, содержит кардиостимуляторы клетки сердца, и дисфункция этой области может вызвать тахикардию или брадикардию. Надежная идентификация дефектов кардиостимуляжа требует измерения внутренней частоты сердечных сокращений, в значительной степени предотвращая влияние вегетативной нервной системы, которая может маскировать дефицит частоты. Традиционные методы анализа внутренней функции кардиостимулятора включают вегетативную блокаду, вызванную лекарственными средствами, для измерения частоты сердечных ритмов in vivo, изолированные записи сердца для измерения внутренней частоты сердечных ритмов и синоатриальную полосу или одноклеточные записи зажимов синоатриальных клеток кардиостимулятора для измерения скорости спонтанного действия потенциального возбуждения. Тем не менее, эти более традиционные методы могут быть технически сложными и трудными для выполнения. Здесь мы представляем новую методологию измерения внутренней частоты сердечных возбуждений путем выполнения записей микроэлектродной решетки (MEA) препаратов синоатриального узла с цельным креплением у мышей. MEA состоят из нескольких микроэлектродов, расположенных в виде сетки для регистрации потенциалов внеклеточного поля in vitro. Способ, описанный в настоящем описании, имеет комбинированное преимущество в том, что он относительно быстрее, проще и точнее, чем предыдущие подходы к регистрации внутренней частоты сердечных частот, а также позволяет легко проводить фармакологический опрос.
Introduction
Сердце является сложным органом, управляемым как сердечными, так и внешними влияниями, такими как те, которые происходят в мозге. Синоатриальный узел (SAN) представляет собой определенную область в сердце, в которой находятся клетки кардиостимулятора (также называемые синоатриальными клетками или клетками SA), ответственные за инициирование и увековечение сердцебиения млекопитающих1,2. Внутренняя частота сердечных сокращений - это частота, управляемая клетками кардиостимулятора без влияния других сердечных или нервно-гуморальных влияний, но традиционные показатели частоты сердечных сокращений у людей и живых животных, такие как электрокардиограммы, отражают как кардиостимулятор, так и нейронные влияния на сердце. Наиболее заметное нейронное влияние на клетки SA происходит от вегетативной нервной системы, которая постоянно модулирует паттерны возбуждения для удовлетворения физиологических потребностей организма3. Поддерживая эту идею, как симпатические, так и парасимпатические проекции можно найти рядом с SAN4. Внутренняя сердечная нервная система (ICNS) является еще одним важным нейронным воздействием, где ганглионированные плексии, особенно в правых предсердиях, иннервируют и регулируют активность SAN5,6.
Понимание дефицита кардиостимуляциона клинически важно, так как дисфункция может лежать в основе многих сердечных расстройств, а также способствовать риску других осложнений. Синдром больного синуса (ССС) – это категория заболеваний, характеризующаяся дисфункцией синоатриального узла, которая препятствует правильному кардиостимуляции7,8. ССС может присутствовать при синусовой брадикардии, синусовых паузах, синусовой остановке, синоатриальном выходном блоке и чередующихся брадиаритмиях и тахиаритмиях9 и может привести к осложнениям, включая повышенный риск эмболического инсульта и внезапной смерти8,10. Люди с синдромом Бругада, сердечным расстройством, отмеченным фибрилляцией желудочков с повышенным риском внезапной сердечной смерти, подвергаются большему риску аритмогенных событий, если у них также есть коморбидная дисфункция SAN11,12. Синоатриальная дисфункция также может иметь физиологические последствия за пределами сердца. Например, было замечено, что SSS вызывает судороги у пациента из-за гипоперфузии головного мозга13.
Чтобы выявить синоатриальный дефицит кардиостимуляции, внутреннюю частоту сердечных сокращений необходимо определить путем измерения активности SAN без влияния вегетативной нервной системы или гуморальных факторов. Клинически это может быть аппроксимировано фармакологической вегетативной блокадой14,но этот же метод также может быть применен в моделях млекопитающих для изучения внутренней сердечной функции15,16. Хотя этот подход блокирует большую часть вносящих вклад нейронных влияний и позволяет проводить исследование сердца in vivo, он не полностью устраняет все внешние воздействия на сердце. Другим методом исследования, используемым для изучения внутренней сердечной функции на животных моделях, являются изолированные записи сердца с использованием перфузированных Лангендорфом сердец, которые обычно включают измерения с использованием электрограмм, кардиостимуляции или эпикардиальных многоэлектродных массивов17,18,19,20. Хотя этот метод более специфичн для сердечной функции, поскольку он включает в себя удаление сердца из организма, на измерения все еще могут влиять механоэлектрические механизмы авторегуляции, которые могут влиять на внутренние измерения частоты сердечных сокращений21. Изолированные записи сердца также могут по-прежнему подвергаться влиянию вегетативной регуляции через ICNS5,6,22,23. Кроме того, поддержание физиологически значимой температуры сердца, которая имеет решающее значение для измерения сердечной функции, может быть затруднено при изолированных сердечных приближенияхк 20. Более прямым методом изучения функции SAN является специальное выделение ткани SAN и измерение ее активности. Это может быть достигнуто с помощью полосок SAN (изолированная ткань SAN) или изолированных клеток кардиостимулятора SAN24,25. Оба требуют высокой степени технической подготовки, так как SAN является очень маленькой и четко определенной областью, и изоляция клеток представляет собой еще большую проблему, поскольку диссоциация может повредить общему здоровью клетки, если она не выполняется правильно. Кроме того, эти методы требуют экспертных электрофизиологических навыков для успешной записи из ткани или клеток с использованием отдельных регистрируя микроэлектроды.
В этом протоколе мы описываем метод записи SAN in vitro с использованием микроэлектродной матрицы (MEA) для получения внутренних измерений сердечного ритма. Преимущество этого подхода в том, что он делает высокоспецифичные электрофизиологические записи доступными для исследователей, не обладающих интенсивными электрофизиологическими навыками. MEAs ранее использовались для изучения функции кардиомиоцитов в первичных культурах кардиомиоцитов26,27,28,29,30,31,32,сердечных листах33,34,35,36,37,38,39и целых тканевых креплениях40, 41,42,43,44,45,46,47. Предыдущая работа также была выполнена для изучения полевых потенциалов в ткани SAN41,42. Здесь мы предоставляем методологию использования MEA для регистрации и анализа скорости стрельбы по SAN, присущей муринам. Мы также описываем, как этот метод может быть использован для проверки фармакологического воздействия лекарств на внутреннюю скорость срабатывания SAN, предоставив выборочный эксперимент, показывающий эффекты 4-аминопиридина (4-AP), блокатора каналов K+ с напряжением. Используя определенные анатомические ориентиры, мы можем точно записать SAN без необходимости выполнять обширные рассечения тканей или изоляцию клеток, необходимые в других методах. В то время как MEA может быть непомерно дорогим, записи обеспечивают очень специфические и надежные показатели кардиостимуляции, которые могут использоваться в широком спектре клинических и физиологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, были проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения (NIH), утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Южном методистском университете.
1. Покрытие многоэлектродной матрицы (MEA) для записи
- Сделайте 25 мМ боратного буфера.
- Растворить 0,953 г Na2B4O7·10 H2O в 80 мл дистиллированной воды.
- Отрегулируйте рН до 8,4 с HCl, а затем добавьте дистиллированную воду до конечного объема 100 мл.
- Сделайте 0,1% раствор полиэтиленимина (PEI).
- Добавьте 100 мкл 50% (мас./об.) PEI к 4,9 мл дистиллированной воды, чтобы получить 1% раствор PEI.
- Разбавляют 1% раствор PEI до 0,1% в боратном буфере, добавляя 1 мл 1% раствора PEI к 9 мл буфера бората 25 мМ.
- Пипетка ~1 мл 0,1% раствора PEI в тарелку микроэлектродного массива (MEA) таким образом, чтобы электроды были полностью покрыты(рисунок 1A и 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроэлектроды МЭА обычно состоят из платиновой черной или углеродной нанотрубки и изолированы полиимидом (или акрилом); оба материала являются гидрофобными. Покрывая MEA катионным полимером, таким как PEI, гидрофобная поверхность MEA становится более гидрофильной, что позволяет образцам тканей лучше контактировать с поверхностью MEA(рисунок 1A1). - Накройте посуду MEA термопластичной пленкой для уменьшения испарения и оставьте MEA на ночь при комнатной температуре(рисунок 1C).
- Аспирировать раствор PEI из чашки MEA с помощью пипетки, стараясь не коснуться электродной сетки, которая может повредить электроды, а затем промыть ≥4 раза дистиллированной водой(рисунок 1D).
- Храните MEA с покрытием PEI под 1-2 мл сверхчистой воды и запечатанным термопластичной пленкой при 4 °C до тех пор, пока это не понадобится. В качестве альтернативы можно хранить MEA с покрытием, погружая его в замок, наполненный сверхчистой водой(рисунок 1E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс нанесения покрытия PEI необходимо выполнять только один раз для MEA перед его первым использованием, и после каждого сеанса записи MEA следует хранить погруженным в сверхчистую воду.
2. Приготовление полного раствора Tyrode для рассечения тканей
- Сделайте 1 000 мл полного раствора Tyrode для рассечения; Сначала добавьте 8,1816 г NaCl к 800 мл сверхчистой воды.
- Добавьте в раствор следующее количество химических веществ: 0,4025 г KCl; 0,1633 г KH2PO4; 1,1915 г HEPES; 0,9999 г глюкозы; 0,0952 гMgCl2; 0,2646 г CaCl2·2H2O.
- Отрегулируйте pH до 7,4 с NaOH, а затем добавьте сверхчистую воду, пока общий объем не составит 1000 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный состав полного раствора тирода будет следующим (в мМ): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4,5 HEPES, 5,55 глюкозы, 1 MgCl2,1,8 CaCl2.
3. Подготовка насыщенного кислородом раствора Тирода для записи
- Сделать 500 мл раствора Тирода; добавьте 4,003 г NaCl к 400 мл сверхчистой воды.
- Добавьте в раствор следующие количества химических веществ: 0,651 г NaHCO3; 0,042 г2PO4; 0,132 г CaCl2·2H2O; 0,149 г KCl; 0,0476 гMgCl2; 0,999 г глюкозы.
- Отрегулируйте pH до 7,4 с HCl, а затем добавьте сверхчистую воду до тех пор, пока общий объем не составит 500 мл.
- Насытить раствор карбогеном кислородом не менее 30 мин при комнатной температуре перед началом записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный состав раствора тирода будет следующим (в мМ): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3,0,72PO4,1,8 CaCl2,4 KCl, 1 MgCl2,11,1 глюкозы. Этот раствор Тирода имеет немного отличный состав от раствора Полного Тирода, используемого для рассечения.
4. Приготовление раствора 4-аминопиридина (4-AP) для фармакологической модуляции
- Сделать 1 мМ рабочий раствор 4-AP; добавьте 18,82 мг 4-AP к 200 мл раствора Тирода с этапа 3.
- Насытить раствор 4-АП кислородом не менее чем за 30 мин до начала эксперимента.
5. Подготовка чашки Петри к рассечению
- Смешайте компоненты силиконового эластомера в соотношении 10:1 (по весу) основания к отверждателю.
- Налейте ~15 мл силиконовой эластомерной смеси в чашку Петри диаметром 60 мм.
- Дайте эластомеру отверждаться при комнатной температуре в течение 48 ч перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Силиконизированная чашка Петри может быть повторно удоблена для будущих вскрытий.
6. Рассечение синоатриального узла (SAN)
- Приготовьте гепаринизированный раствор Complete Tyrode для рассечения SAN.
- Добавьте 400 мкл гепарина (1000 USP/мл) к 40 мл раствора Complete Tyrode и нагрейте на водяной бане с 37 °C.
- Вводят мыше внутрибрюшинно 200-300 мкл гепарина (1000 USP/мл) и дайте животному посидеть в течение 10 минут.
- Усыпить гепаринизированную мышь при передозировке изофлурана.
- Поместите мышь в небольшую стеклянную камеру, которая содержит пары изофлунана, образующиеся при добавлении 200-300 мкл жидкого изофлурана в фильтровальную бумагу внутри перфорированной пластиковой трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку изофлуран может вызвать раздражение кожи, а также может всасываться через кожу, жидкость не должна напрямую контактировать с мышью. Поэтому пропитанную изофлураном салфетку помещают в перфорированную трубку для введения. - Убедитесь в смерти прекращением движения и дыхательного усилия, а также отсутствием рефлекса защемления на носе. Смерть обычно занимает около 1-2 мин после помещения в камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смерть обычно сопровождается мочеиспусканием.
- Поместите мышь в небольшую стеклянную камеру, которая содержит пары изофлунана, образующиеся при добавлении 200-300 мкл жидкого изофлурана в фильтровальную бумагу внутри перфорированной пластиковой трубки.
- Поместите мышь в лежачее положение на доске для рассечения с вытянутыми лапами и прикрепите лапы к доске с помощью игл для шприца длиной 1 дюйм 23-го калибра. Затем удалите мех в непосредственной близости от дна грудной клетки хирургическими ножницами и срезав мех у корней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для рассечения можно использовать крышки полистирольного охладителя. - Удерживая кожу гемостатом, используйте хирургические ножницы, чтобы сделать поперечный разрез в коже прямо под нижней частью грудной клетки примерно от левой реберной дуги до правой реберной дуги(рисунок 3A).
- Разрезайте брюшину хирургическими ножницами и аккуратно отделите печень от диафрагмы, стараясь не проколоть печень, что вызовет чрезмерное кровотечение(рисунок 3B). Разрезайте диафрагму вдоль грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость(рисунок 3C-D).
- Используя хирургические ножницы, отрежьте боковые стенки грудной клетки от краев реберных дуг до клавиц, чтобы обнажить сердце, стараясь избежать повреждения сердца(рисунок 3D). Затем используйте иглу шприца 23-го калибра, чтобы закрепить грудную клетку через плечо, удерживая ее на месте и вне пути хирургического поля.
- Используйте переносную пипетку, чтобы капать теплый (37 °C) гепаринизированный раствор Complete Tyrode на сердце, чтобы сохранить его влажным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте сердцу высохнуть. - Удалите легкие, удерживая их с помощью дополнительных тонких щипцов Graefe и разрывая трахею хирургическими ножницами(рисунок 3E).
- Удерживайте верхушку сердца с помощью дополнительных тонких щипцов Graefe и удалите ее, разрезав аорту и вену с помощью хирургических ножниц. Переложите сердце в чашку Петри, содержащую отвержденный силиконовый эластомер(рисунок 4А)и используйте переносную пипетку для купания сердца 2-3 мл теплого (37 °C) гепаринизированного раствора Complete Tyrode.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить нежную заднюю стенку правого предсердия, которая содержит SAN, и соединенные правые предсердные вены. Купание сердца раствором Complete Tyrode удерживает сердце от высыхания, но не полностью погружает сердце в раствор, так как это ухудшит видимость во время рассечения. - Ориентируйте сердце правым предсердием справа от экспериментатора и левым предсердием слева от экспериментатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение ткани SAN должно быть сделано быстро, чтобы предотвратить травму, связанную с ишемией. - Прикрепите верхушку сердца к блюду с помощью рассеченной булавки. Затем, удерживая нижнюю полую вену с помощью щипцов дюмона #2 ламинэктомии, вставьте иглу шприца 22 Г через нижнюю и верхнюю полую вену, чтобы найти их положение в правом предсердии, что также определяет приблизительное положение SAN (расположенное в пятне ткани между нижней и верхней полой веной(рисунок 4B).
- Используя небольшие рассеченные булавки, прикрепляйте к блюду левые и правые предсердные придатки.
- Удерживая левый предсердный придаток Дюмоном #2 щипцами для ламинэктомии, вставьте рассеченный штифт через придаток левого предсердия, чтобы удержать его на месте.
- Удерживая правый предсердный придаток Дюмоном #55 щипцах, проложите рассеченный штифт через правый предсердный придаток, чтобы удержать его на месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании один и тот же тип щипцов можно использовать для удержания левых и правых предсердных придатков.
- Удалите шприцевую иглу, которая охватывает venae cavae.
- Чтобы освободить кровь из сердца, используйте ножницы Castroviejo для удаления верхушки сердца (то есть нижней половины), сделав поперечный разрез через желудочки(рисунок 4C). Затем промыть сердце, добавив теплый (37 °C) гепаринизированный раствор Complete Tyrode с передаточной пипеткой.
- Используйте ножницы Castroviejo, чтобы разрезать вдоль атриовентрикулярной перегородки, сохраняя разрез ближе к желудочку, чем к предсердиям. Продолжайте разрезать вдоль атриовентрикулярной перегородки до тех пор, пока предсердия не отделятся от желудочков.
- Разрезать вдоль межпредсердной перегородки, чтобы удалить левое предсердие.
- Поместите рассеченные штифты на периферии правого предсердия, чтобы он лежал плоским(рисунок 4D). Удалите оставшийся жир, сосуды или ткани из предсердия с помощью ножниц Castroviejo.
- Расположить SAN в правом предсердии, которое в этой ориентации приблизительно граничит с верхней полой веной (сверху), нижней полой веной (снизу) и cristae terminalis(слева) (рисунок 4D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Crista terminalis выглядит как темный мышечный гребень между правым предсердным придатком и SAN. Часто артерию SAN также можно увидеть пронизывающим через SAN(рисунок 4D).
7. Подготовка системы MEA к записи
- Добавьте раствор Тирода (из шага 3) во входной баллон с раствором(рисунок 5C)и насыплите его кислородом, включив поток карбогенного газа(рисунок 5A)в систему.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Тирода, используемый для записи, немного отличается по составу от раствора Полного Тирода, используемого для вскрытия. - Проверяют поток карбогена, наблюдая пузырьки в конической колбе, которая используется для увлажнения газа(рисунок 5В),и входном растворе баллона(рисунок 5С).
- Вставьте трубку притока перистальтического насоса(рисунок 5D)в регистрирующий раствор Tyrode(рисунок 5C). Затем вставьте трубку оттока перистальтического насоса в бутылку для сбора(рисунок 5I).
- Установите перистальтический насос на 25 об/мин, что дает скорость потока 2 мл/мин и запустите насос. Проверьте систему на наличие утечки или переполнения буфера.
- Установите регулятор температуры на 37 °C, физиологическую температуру мышей(рисунок 5E).
8. Размещение сердечной ткани на сетке MEA
- Перенесите рассеченную ткань SAN с помощью кисти(рисунок 6A)из рассекающей чашки Петри на сетку MEA(рисунок 1A1).
- Глядя под перевернутый микроскоп, аккуратно расположите ткань мягкой кистью так, чтобы область SAN накладывалась на электродную сетку.
- Перепозиционировать ткань по мере необходимости, чтобы убедиться, что она лежит ровно на электродной сетке, обеспечивая хороший контакт с электродами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкая кисть для перемещения ткани необходима, чтобы избежать повреждения электродной сетки.
- Как только ткань будет правильно позиционирована, используйте костные щипцы (или любые изогнутые щипцы), чтобы поместить сетку поверхткани (рисунок 6A). Затем используйте костные щипцы, чтобы поместить анкен дляарфы (рисунок 6A)на сетку, чтобы удерживать все на месте(рисунок 6B).
- Сделайте снимок позиционирования ткани на МЭА так, чтобы активность отдельных электродов могла быть коррелирована с их анатомическим расположением во время записи. Это можно сделать, поднеся смартфон к объективу перевернутого микроскопа или используя прикрепленную камеру микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ориентация MEA не изменяется после съемки, верхний левый электрод будет отображаться как первый канал (Ch1) во время записи. - Поместите тарелку MEA на соединительную пластину(рис. 5F и 6C)и аккуратно поместите перфузионный колпачок(рисунок 6C)на тарелку MEA, не нарушая анкеля для ломтика арфы. Перфузионный колпачок может быть дополнительно закреплен с помощью куска лабораторнойленты (рисунок 6C).
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к регулируемым приточным и оттоковым трубам раствора, колпачок также имеет порт для подачи газа(рисунок 6C). Кроме того, кольцо опорного электрода проходит через колпачок(рисунок 6C). - Дайте ткани восстановиться после обработки и акклиматизироваться в камере за 15-20 минут до записи.
9. Настройка протокола сбора данных для записи
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают открытие программного протокола для спонтанной записи битов и определение условий записи. Специфика этих шагов может варьироваться в зависимости от конкретного используемого программного обеспечения, но общий план должен оставаться неизменным.
- Включите усилитель(рисунок 5G)и настройте рабочий процесс для записи в программном обеспечении на компьютере(рисунок 5H).
- Откройте программное обеспечение и нажмите на Рабочий процесс.
- Выберите Открыть новую папку.
- Откройте папку «Из шаблонов».
- Выберите 64MD1-1920X1080 (в зависимости от разрешения рабочего стола).
- Откройте папку QT.
- Откройте папку Спонтанной записи.
- Выберите шаблон Beat_recording.moflo и откройте его(рисунок 7A).
- Установите параметры записи, чтобы указать количество трассировок, длительность трассировки, интервал трассировки, входное напряжение, частоту дискретизации и т. Д., В соответствии с желаемыми условиями записи(рисунок 7B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения данных о частоте биения и межвыводящем ритме обычно используют входной диапазон напряжения 2,9 мВ, фильтр высоких частот 1 Гц, фильтр нижних частот 1000 Гц и частоту дискретизации 20 кГц. - Чтобы отметить различные фазы или условия эксперимента, например, до и после введения препарата, нажмите на вкладку Аннотации, чтобы добавить желаемые обозначения(рисунок 7C).
- Чтобы указать назначение файла для собираемых данных, установите флажок Включить хранилище и введите требуемое имя файла в поле Модификатор имени файла.
10. Выполнение записи и сбор данных
- Нажмите кнопку «Запись и воспроизведение» в самой верхней строке меню программного обеспечения для сбора данных, чтобы начать запись. Получение данных по 10 следам длительностью 1 мин с интервалами 2 мин между следами.
- Из этих начальных следов убедитесь, что записанные формы сигналов согласуются со здоровой и высококачественной тканевой подготовкой, подтвердив, что большинство каналов записи демонстрируют амплитуды сигнала ≥ 0,5 мВ и идентичные межсковочные интервалы(рисунок 8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная оценка активности и формы сигналов отдельных микроэлектродов, соответствующих их анатомическим расположениям, может быть выполнена путем ссылки на картину, полученную после позиционирования ткани на МЭА. - Чтобы измерить влияние лекарств на ткани, приостановите запись после получения исходных исходных данных, нажав кнопку паузы в самой верхней строке меню.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фазу лекарственного ответа эксперимента можно записать в записи, щелкнув вкладку Аннотации и добавив желаемую нотацию, как описано выше(рисунок 7C). - Приостановите насос и переключите втулку насоса с обычного регистрируемого раствора на раствор Тирода, содержащий желаемый препарат по выбору.
ПРИМЕЧАНИЕ: В примере эксперимента раствор Тирода использовали с 1 мМ 4-аминопиридином (4-AP). - Перезапустите насос и спустите паузу, чтобы снова начать сбор данных.
- После того, как раствор Тирода, наполненный лекарственным средством, достиг ткани, запишите 10 следов таким же образом, как это было сделано ранее для исходных записей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для стабилизации следов потребуется некоторое время, когда препарат вливается в камеру записи. Механизм действия препарата также может влиять на стабильность записи. Для препаратов, имеющих обратимые механизмы действия, также должен быть зафиксирован период вымывания для подтверждения восстановления активности до исходных уровней, что является показателем здоровой ткани. - Нажмите кнопку Стоп, чтобы завершить запись.
- Сделайте окончательный снимок позиционирования ткани на MEA под микроскопом в случае, если ткань сместилась после первоначальной процедуры настройки записи.
11. Очистка настроек после записи
- Очистите MEA.
- После завершения записи аккуратно извлеките записывающий раствор из чашки MEA с помощью микропипетки 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не контактировать с электродами MEA, которые могут повредить их. - Снимите якорь сетки и арфы костными щипцами (или любыми изогнутыми щипцами). Затем используйте кисть для вытеснирования ткани с поверхности MEA, всегда стараясь не касаться отдельных микроэлектродов.
- Используя бутылку для мытья, осторожно промойте посуду MEA сверхчистой водой примерно 3-4 раза.
- Храните очищенный MEA, погруженный в сверхчистую воду при 4 °C.
- После завершения записи аккуратно извлеките записывающий раствор из чашки MEA с помощью микропипетки 1 мл.
- Промывайте системную трубку, пропуская через нее сверхчистую воду не менее 5 минут, используя настройку максимальной скорости на перистальтическом насосе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения грибкового роста не следует оставлять воду или буферный раствор внутри трубки после очистки.
12. Анализ записей MEA для измерения частоты ударов SAN
- Откройте сохраненный файл записанных данных в шаблоне "Beat_frequency_analysis" аналитического программного обеспечения(рисунок 9).
- Нажмите кнопку «Воспроизвести» и позвольте запустить всю запись, чтобы визуализировать набор данных и назначить соответствующие параметры анализа.
- Выберите окно биннинга для требуемого формата отображения данных, независимо от того, отображается ли оно как среднее значение за трассировку или среднее за время(рисунок 10A).
- Выберите каналы, которые будут включены в анализ, и установите требуемые максимальные значения амплитуды или пороговые значения амплитуды для автоматической идентификации пика формы сигнала(рисунок 10B).
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе для анализа может быть выбран отдельный канал, комбинация каналов или все 64 канала(рисунок 9). Если выбранные пороговые значения слишком близки к максимальным и минимальным значениям формы сигнала, некоторые пики формы сигнала могут быть не идентифицированы аналитическим программным обеспечением. - Задайте количество времени до и после всплеска, которое будет включено в анализ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки 50 мс до всплеска и 100 мс после всплеска обычно работают хорошо(рисунок 10B).
- После установки условий анализа снова нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы повторно запустить набор данных и подтвердить, что параметры анализа подходят для извлечения шипов.
- Для анализа определите три наиболее стабильных последовательных следа, которые демонстрируют стабильную скорость биения для каждого следа по большинству каналов как в течение исходного периода эксперимента, так и еще трех последовательных стабильных следов в течение периода воздействия наркотиков(рисунок 10A).
- Укажите начальную и конечную трассировки для анализа и введите продолжительность каждой трассировки, которая будет анализироваться(рисунок 9).
- Перед началом анализа установите флажки включения для Интервал сохранения ритма в минуту и Интервал сохранения интервала между ударами (рисунок 10B).
- Введите желаемое имя файла в поле Модификатор File name (рисунок 10B). Проанализированные данные по частоте биения и интервалу интерспайка будут сохранены в виде ASCII (текстового) формата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа различных состояний (таких как исходный уровень и реакция на лекарства) анализ должен проводиться отдельно для каждого состояния. - Нажмите кнопку Воспроизведение и запись на верхней панели вкладок, чтобы начать анализ.
- Чтобы экспортировать данные для других приложений, установите флажки Сохранить ритм в минуту и Сохранить интервал между ударами (рисунок 10B). Введите нужное имя файла в поле Модификатор File name (рисунок 10B)и нажмите кнопку Save, чтобы сохранить проанализированные данные в текстовом формате ASCII в выбранной папке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После того, как ткань акклиматизируется в блюде в течение 15 мин, регистрируется 10 одномиминные следы. Наш текущий протокол регистрирует активность более часа, но мы зафиксировали стабильные паттерны стрельбы в течение ≥4 ч в неопубликованных данных, не показанных здесь. Если экспериментальная подготовка хороша для сбора данных, каждый канал записи должен демонстрировать последовательные и равномерно расположенные повторяющиеся формы сигналов (т.е. шипы) однородной формы для данного канала(рисунок 11D). Эти формы сигналов соответствуют индивидуальным сердечным ударам, которые отражают внутреннюю активность кардиостимуля. Интервалы между плайками должны быть одинаковыми для каждого канала, даже если они не могут быть идеально выровнены по каналам из-за небольших различий в их расположении относительно места инициации деполяризации(рисунок 8). Хотя форма осциллограмм для данного канала должна быть последовательной, форма формы сигнала будет варьироваться в зависимости от расположения электрода в ткани(рисунок 8). Степень контакта ткани с электродом может также влиять на характеристики формы сигнала, такие как амплитуда. Однако максимумы амплитуды должны составлять не менее 0,5 мВ для большинства каналов, если препарат удовлетворительный. Из 10 зарегистрированных следов были выбраны три последовательных канала, которые наилучшим образом соответствуют критериям качества, описанным выше, для дальнейшего анализа, описанного ниже. На рисунке 10А показан образец стабильной частоты биения (верхняя панель) и интервала межшпийка (средняя панель) для трех последовательных трасс. Ткань, которая не соответствует этим критериям, не должна регистрироваться, так как существует вероятное повреждение тканей, которое будет препятствовать точному сбору данных. На рисунке 11 показаны примеры плохо извлеченных паттернов всплесков, которые либо отсутствуют(A),либо подвержены влиянию шума(B),либо нестабильны(C).
Выборочные данные, отображаемые на рисунках, были собраны у 45-дневного самца дикого типа черной швейцарской мыши (Tac: N: NIHS-BC). Процедура анализа, показанная на рисунках 9 и 10, использовалась для извлечения внутренней скорости стрельбы и отображения базовых пиков, которые можно увидеть на рисунке 12A. Скорость стрельбы - это средняя скорость через 60 000 мс от каждого из трех следов, но картина всплеска на рисунке 12A показывает 5 с репрезентативного всплеска от одного следа. Используя автоматизированное аналитическое программное обеспечение, внутренняя скорость срабатывания (т.е. частота ударов) выбранных трех трасс по всем 64 каналам была обнаружена примерно в 320 уд/мин в наших выборочных данных(рисунок 12A). В целом, мы наблюдаем диапазон значений около 290-340 пп/мин в наших записях для мышей дикого типа. Скорострельный также может быть использован в качестве вторичного метода оценки качества подготовки. Показатели, которые либо нестабильны, либо значительно ниже 300 пп/мин, с меньшей вероятностью будут хороши для анализа. Эти значения сопоставимы как с изолированными сердечными, так и с одиночными клеточными записями, которые сообщают о внутренней частоте сердечных выделений в диапазоне примерно 300-500 ударов в минуту25,48,49. Таким образом, метод записи MEA способен генерировать надежные и точные измерения внутренней частоты сердечных сокращений.
Преимуществом системы MEA является то, что она позволяет легко применять лекарственные средства для проверки фармакологических эффектов. В образце эксперимента мы проверили влияние 1 мМ 4-AP на скорость срабатывания, что должно замедлить активность SAN, поскольку известно, что блокада каналовK+ с напряжением ухудшает реполяризацию потенциала действия в ячейках SA24,50. На рисунке 12В показано, что введение 4-AP увеличило интервалы между ударами, как и ожидалось. Этот длительный интервал всплесков соответствовал снижению частоты ударов с 320 уд/мин до 210 уд/мин. Эта скорость стрельбы после введения 4-AP аналогична предыдущему исследованию, в котором изучалось влияние 4-AP на скорость срабатывания SAN с использованием записей одного электрода изолированной ткани. Это исследование измеряли скорость стрельбы примерно 190 ударов в минуту в присутствии 4-AP50. Таким образом, система MEA может быть использована в качестве удобного и ценного инструмента для тестирования фармакологических эффектов лекарственных вмешательств на внутреннюю сердечную функцию.
Рисунок 1:Покрытие микроэлектродной решетки (MEA) перед использованием. (A) MEA состоит из небольшой пластиковой тарелки с сеткой из 64 микроэлектродов в центре (как показано на панели A1)и четырьмя опорными электродами по периферии в квадратном рисунке. (B)Добавление 1 мл буфера PEI для покрытия MEA. (C) Покрытие посуды MEA термопластичной пленкой для инкубации в течение ночи при комнатной температуре. (D)Аспирирование буфера PEI из чашки MEA, за которым следуют, по крайней мере, четыре ополаскиваемой водой с дистиллированной водой. (E)Хранение зонда MEA с покрытием под сверхчистой водой для предотвращения его высыхания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Инструменты, используемые для рассечения синоатриального узла (SAN). Во время рассечения используются следующие инструменты протокола: (i) чашка Петри с силиконовым эластомером и небольшими штифтами для рассечения; ii) пластиковая трансферная пипетка; iii) ножницы Кастровьехо, размер 4"; iv) хирургические ножницы (прямые) для режущих процедур; v) щипцы Дюмона #2 ламинэктомии; vi) Дюмон #55 щипцы; vii) сверхтонкие щипцы Грефе; viii) гемостаты (изогнутые). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Удаление сердца. (А) Поперечный разрез в коже непосредственно под нижней частью грудной клетки примерно от левой реберной дуги до правой реберной дуги. (В) Перитонеальный разрез. (С,D) Разрез диафрагмы вдоль грудной клетки для обнажения грудной полости. (E) Удаление сердца после иссечения легких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Рассечение синоатриального (SAN) узла. (A)Появление сердца в чашке Петри после удаления из организма. (B)Введение шприцевой иглы через нижнюю полую вену (IVC) и верхнюю полую вену (SVC) правого предсердия. Булавка в вершине сердца также показана. (C)Иссечение верхушки (т.е. нижней половины) сердца для высвобождения крови. Также показаны штифты в придатках предсердий. (D) Окончательное появление области SAN правого предсердия в конце рассечения. Область в коробке соответствует приблизительным расположениям SAN. Артерию SAN также можно слабо увидеть, пронизывая SAN в вертикальной ориентации. Сокращения: АО, аорта; КТ, криста терминалис; IVC, нижняя полая вена; Л.А., левое предсердие; РА, правое предсердие; RAA, придаток правого предсердия; SAN, синоатриальный узел; SVC, верхняя полая вена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Схема настройки системы записи микроэлектродной матрицы (MEA). Следующие компоненты составляют систему:(А) газовыйбаллон (карбоген: 95% O2/ 5% CO2); (B)коническая колба с дистиллированной водой для увлажняющего газа; (C)запись бутылки с раствором Tyrode, которая обеспечивает приток к чашке MEA; (D)перистальтический насос для перекачки раствора в чашку MEA и из нее; (E)регулятор температуры; (F)Соединительная пластина MEA, которая принимает сигналы от тарелки MEA; (G)усилитель; (H)компьютер; (I)Бутылка для сбора использованного раствора отходов из посуды MEA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Позиционирование узловой ткани SA на MEA. (A)Инструменты, используемые при позиционировании ткани: (i) сетка с размером сетки 1,5 мм, (ii) анкеридж для арфы, (iii) костные щипцы, (iv) кисть для краски. (B) Позиционирование ткани на MEA. Желтая рамка указывает приблизительную площадь области синоатриального узла под сеткой и якорем в чашке MEA. (C)Расположение чашки MEA с заключенной тканью на соединительной пластине для регистрации потенциала поля: i) вход для регистрируемого раствора; ii) вход для газа (карбоген); iii) выход для решения; iv) микроэлектродная соединительная пластина; v) перфузионный колпачок; vi) кольцо опорного электрода, прикрепленное к колпачку; vii) лента для удержания колпачка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Настройка протокола сбора данных в программном обеспечении. (A) Пример шаблона записи, показывающий расположение всех 64 каналов. (B) Пример свойств программного ввода для условий записи. (C) Пример меню Аннотации, показывающее, как добавить новую фазу во время записи, например, для измерения эффектов лекарств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:Различные области тканей, показывающие различные формы сигналов активности. Пример снимка экрана, на котором показаны осциллограммы с различными формами и амплитудами в разных каналах. Тем не менее, все каналы показывают одинаковые интервалы между ударами и частоты стрельбы. Каналы внутри красной коробки примерно соответствуют электродам, размещенным в области SAN ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9:Шаблон анализа частоты ударов. Пример шаблона, показывающий расположение всех 64 каналов в шаблоне анализа частоты ударов. Во вставке Файла необработанных данных воспроизведения приведен пример входных свойств окна анализа. В этом примере для анализа были выбраны трассировки от 5 до 7, а продолжительность анализа для каждого следа была обозначена как 60 000 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10:Определение параметров анализа для извлечения шипов. (A) Репрезентативные результаты шаблона анализа для 3 выбранных трасс одного канала. Верхняя панель отображает частоту биения для трех выбранных трасс (три определенные группы точек данных), и каждая точка представляет собой среднее значение частоты ударов за 10 с во время конкретной трассировки. На средней панели отображается межсюковый интервал для трех выбранных трассировок (три определенные группы точек данных), а каждая точка данных представляет межсюковый интервал между двумя последовательными пиками. Нижняя левая панель показывает выбранные репрезентативные извлеченные шипы за последние 5 с третьего следа, тогда как нижняя правая панель показывает извлеченную форму сигнала, полученную из 5-с группы извлеченных шипов в нижней левой панели. (B) Расширенный вид окна анализа, показывающий параметры, используемые при анализе частоты биения для 3 трасс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11:Репрезентативный рисунок, показывающий хорошее и плохое извлечение данных для конкретного канала. Плохое извлечение данных: (A) Отсутствие извлеченных шипов; (B)Извлеченные шипы с шумовыми сигналами; (C) Нестабильные извлеченные шипы. (D) Хорошие данные, показывающие стабильные извлеченные всплески без шумовых сигналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 12:Записи на исходном уровне и после введения 1mM 4-аминопиридина (4-AP). (A)Базовая запись с одного микроэлектрода показывает формы сигналов со стабильной частотой срабатывания 320 420 уп/мин в сердце WT. (B) После введения 4-AP частота выстрела замедляется до стабильной скорости 210 ударов в минуту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Практика и освоение процесса рассечения SAN является обязательным, поскольку ткань хрупкая, а здоровая ткань необходима для успешной записи. Во время рассечения SAN правильная ориентация имеет важное значение для получения правильной области ткани. Однако первоначальная ориентация сердца может быть легко потеряна во время процесса рассечения, что усложняет это начинание. Поэтому, чтобы обеспечить правильную ориентацию влево-вправо, предсердия должны быть визуально осмотрено. Как правило, правое предсердие имеет тенденцию быть более прозрачным, тогда как левое предсердие обычно темнее и более красного цвета25,48. Кроме того, важно не растягивать ткань SAN во время работы с ней или монтажа на электродную сетку, так как ткань легко механически повреждается51. Совет для проверки здоровой и правильно рассеченной ткани SAN заключается в том, чтобы исследовать ее в растворе Complete Tyrode под микроскопом, чтобы убедиться, что ткань бьется. После того, как техника освоена, по крайней мере, 90% тканевых препаратов должны быть хороши для записи.
Несколько соображений могут повысить вероятность успешной записи и последующего анализа данных. Чтобы обеспечить наилучшие записи, решения должны быть тщательно подготовлены и протестированы на образцах на практических мышах перед экспериментальными записями. Мы много работали над адаптацией и модификацией решения для записи для оптимизации здоровья ткани SAN. Кроме того, убедитесь, что газ, используемый для записи, является карбогеном (т.е. 95% O2/5% CO2). Одноклеточные записи часто используют чистый кислород из-за специфического химического состава раствора Тирода, используемого для этого применения, но раствор, используемый для записи на MEA, требует карбогена для поддержания стабильного рН. Использование чистого кислорода с раствором Тирода для записи MEA вызовет колебания рН, что может привести к быстрому ухудшению состояния ткани. Оценка максимумов амплитуды в каналах, как описано ранее, поможет определить, является ли ткань хорошего качества записи. Наконец, чтобы помочь анализу после записи, очень полезно сделать снимок смонтированной ткани SAN на электродной решетке MEA после завершения записи. Ткань может незначительно смещаться во время первоначальной настройки MEA, и это обеспечивает наиболее точную оценку размещения электродов для анализа.
Мы предлагаем записи MEA как тщательный и точный способ охарактеризовать скорострельную скорость SAN. Преимущество метода MEA заключается в том, что он позволяет экспериментатору захватывать скорости стрельбы наравне с записями одиночных клеток без необходимости иметь обширные электрофизиологические знания. Метод МЭА также имеет преимущество в устранении потенциальных смешанных влияний нейрогуморальных и механоэлектрических механизмов, которые присущи изолированным записям сердца и измерениям вегетативной блокады in vivo 21. Желудочковое сокращение и дыхание являются основными механоэлектрическими воздействиями, которые могут изменить SAN-возбуждение, но они устраняются в нашем тканевом препарате 52,53. В то время как наш метод устраняет большинство автономных влияний на SAN, ограниченное количество оставшихся проекций ICNS в правых предсердиях может потенциально повлиять на запуск SAN, теоретическое ограничение, которое следует иметь в виду при интерпретации результатов5,6,22,23. Еще одним преимуществом техники MEA, описанной здесь, является то, что она может быть адаптирована для многих других типов кардиологических исследований. Например, хотя этот протокол продемонстрировал влияние 4-AP на активность SAN, будущие исследования могут рассмотреть почти неограниченное количество фармакологических агентов, а также влияние генных мутаций на внутреннее возбуждение SAN. Например, ивабрадин, специфический блокатор SAN-специфического канала Hcn4, может быть использован для изучения забавного текущего вклада в скорость стрельбы54. Система MEA также может использоваться для измерения сердечной функции в других областях сердца, что позволяет получить подробную характеристику для конкретного региона. Однако запись из других областей сердца потребует различных подходов к рассечению и возможности тонкого сечения тканей перед записью. Одним из потенциально значительных ограничений этого метода является высокая стоимость покупки системы MEA, которая может быть непомерно высокой. На рынке доступно несколько систем MEA со схожими характеристиками и функциональностью, но высокая стоимость остается прежней. Однако, как только первоначальное оборудование и программное обеспечение приобретены, стоимость обслуживания и использования системы MEA довольно низкая. Другим ограничением является то, что система MEA позволяет регистрировать только внеклеточные потенциалы поля, которые не способствуют точному сравнению характеристик потенциала действия (например, амплитуды и формы) между препаратами, которые могут быть достигнуты с помощью одноклеточных внутриклеточных записей. Таким образом, этот протокол обеспечивает эффективный рабочий процесс для измерения и анализа внутренней частоты сердечных возбуждений в ткани SAN мыши с возможностью изучения влияния фармакологического вмешательства на скорость возбуждения очень специфическим образом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения, номера грантов R01NS100954 и R01NS099188.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D.
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
