Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Shuttle Box Assay как ассоциативный инструмент обучения для когнитивной оценки в обучении и исследованиях памяти с использованием взрослых рыбок данио

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62745
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 3Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

Summary

Обучение и память являются мощными показателями в изучении когнитивных нарушений, вызванных развитием, болезнью или окружающей средой. Большинство когнитивных тестов требуют специализированного оборудования и длительных временных обязательств. Тем не менее, анализ челнока является ассоциативным инструментом обучения, который использует обычную геловую коробку для быстрой и надежной оценки познания взрослых рыбок данио.

Abstract

Когнитивный дефицит, включая нарушение обучения и памяти, является основным симптомом различных нейродегенеративных заболеваний развития и возрастных заболеваний и черепно-мозговой травмы (ЧМТ). Рыбки данио являются важной моделью нейробиологии из-за их прозрачности во время развития и надежных регенеративных способностей после нейротравм. В то время как различные когнитивные тесты существуют у рыбок данио, большинство когнитивных тестов, которые являются быстрыми, исследуют неассоциативное обучение. В то же время ассоциативно-обучающие анализы часто требуют нескольких дней или недель. Здесь мы описываем тест быстрого ассоциативного обучения, который использует неблагоприятный стимул (удар током) и требует минимального времени на подготовку. Представленный здесь анализ челночного ящика прост, идеально подходит для начинающих исследователей и требует минимального оборудования. Мы демонстрируем, что после ЧМТ этот тест челнока воспроизводимо оценивает когнитивный дефицит и восстановление от молодых до старых рыбок данио. Кроме того, анализ адаптируется для изучения либо немедленной, либо замедленной памяти. Мы демонстрируем, что как одиночная ЧМТ, так и повторяющиеся события ЧМТ негативно влияют на обучение и немедленную память, но не задерживают память. Таким образом, мы пришли к выводу, что анализ челнока воспроизводимо отслеживает прогрессирование и восстановление когнитивных нарушений.

Introduction

Обучение и память обычно используются в качестве показателей когнитивных нарушений, которые происходят из-за старения, нейродегенеративных заболеваний или травм. Черепно-мозговые травмы (ЧМТ) являются наиболее распространенными травмами, которые приводят к когнитивному дефициту. ЧМТ вызывают растущую озабоченность из-за их связи с несколькими нейродегенеративными расстройствами, такими как лобно-височная деменция и болезнь Паркинсона1,2. Кроме того, повышенные скопления бета-амилоида, наблюдаемые у некоторых пациентов с ЧМТ, позволяют предположить, что это также может быть связано с развитием болезни Альцгеймера3,4. ЧМТ часто являются результатом травмы тупой силой и охватывают диапазон тяжестей5,причем легкие травмы головного мозга (миТМТ) являются наиболее распространенными. Тем не менее, миТБИ часто не сообщаются и неправильно диагностируются, потому что они приводят к незначительным когнитивным нарушениям только в течение короткого периода, и пострадавшие люди обычно полностью выздоравливают6. Напротив, повторные события миТМТ вызывают растущую озабоченность, потому что она широко распространена у молодых и людей среднего возраста, может накапливаться с течениемвремени 7,может ухудшать когнитивное развитие и усугублять нейродегенеративные заболевания1,2,3,4,5,подобно лицам, которые испытывают либо умеренную, либо тяжелую ЧМТ8.

Рыбка данио (Danio rerio) является полезной моделью для изучения различных тем в нейробиологии, включая способность регенерировать потерянные или поврежденные нейроны по всей центральной нервной системе9,10,11,12,13. Нейронная регенерация также была продемонстрирована в теленцефалоне, который содержит архипаллий в дорсально-внутренней области. Эта нейроанатомическая область аналогична гиппокампу и, вероятно, необходима для познания у рыб и для кратковременной памяти у людей14,15,16. Кроме того, поведение рыбок данио было широко охарактеризовано и каталогизировано17. Обучение изучалось с помощью различных методов, включая привыкание к реакции испуги18,которая может представлять собой быструю форму неассоциативного обучения при выполнении в коротких блоках и с вниманием к быстрому времени распада19. Используются более сложные тесты ассоциативного обучения, такие как Т-боксы, плюс-лабиринты и зрительная дискриминация20,21, но часто они отнимают много времени, требуют дней или недель подготовки и полагаются на мелководье или положительное подкрепление. Здесь мы описываем быструю парадигму для оценки как ассоциативного обучения, так и немедленной или замедленной памяти. Этот анализ челночной коробки использует аверсивный стимул и отрицательное подкрепление для оценки когнитивного дефицита и восстановления после тупой ЧМТ. Мы демонстрируем, что неповрежденные контрольные взрослые рыбки данио (8-24 месяца) воспроизводимо учатся избегать красного света в течение 20 испытаний (<20 минут оценки) в челночной коробке с высокой степенью согласованности среди наблюдателей. Кроме того, используя челнок, мы демонстрируем, что способности к обучению и памяти у взрослых (8-24 месяца) последовательны и полезны для анализа познания со значительными нарушениями между различными тяжестями ЧМТ или повторной ЧМТ. Кроме того, этот метод может быть быстро использован в качестве метрики для отслеживания широкого спектра прогрессирования заболевания или эффективности лекарственных вмешательств, влияющих на поддержание или восстановление познания у взрослых рыбок данио.

Здесь мы предоставляем учебный обзор быстрой когнитивной оценки, которая может исследовать как сложное ассоциативное обучение (раздел 1), так и память с точки зрения как немедленной, так и замедленной памяти. Эта парадигма обеспечивает оценку кратковременной и долговременной памяти выученной ассоциативной когнитивной задачи (раздел 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Рыбки данио выращивались и содержались на объекте Нотр-Дам Даниофиш в Центре наук о жизни Фраймана. Методы, описанные в этой рукописи, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Нотр-Дам (номер страхования благополучия животных A3093-01).

1. Парадигма обучения челночнойкоробке (рисунок 1A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Парадигма обучения обеспечивает быструю оценку познания в отношении ассоциативного обучения.

  1. Подготовьте коробку-шаттл, изменив гелевой ящик размером 30,5 x 19 x 7,5 см с куском плексигласа аквариумного класса размером 5 x 19 см, добавленным к каждой стороне под углом 45°. Сделайте линию, обозначав половину точки резервуара, чтобы оценить, когда рыба пересекла середину аквариума(рисунок 1B).
  2. Добавьте 800 мл системной воды в челнок. Сделайте эту воду, растворив 60 мг Instant Ocean в 1 л деионизированной воды RO. Наполните воду до середины бака на глубину 5 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замените пресной системной водой при 28 °C каждый час или после тестирования 3 рыб.
  3. Поместите 2-3 рыбы в резервуар для хранения, содержащий системную воду, расположенный в темном помещении, где будет проводиться анализ челночной коробки.
    1. В темной комнате поместите 1 рыбу в центр челночной коробки, закрепите крышку и прикрепите электроды к источнику питания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помещение должно оставаться как можно более темным во время акклиматизации и тестирования.
  4. Акклиматизировать рыбу в челноке в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь должен оставаться в комнате в течение периода акклиматизации или спокойно возвращаться в комнату для тестирования с достаточным количеством времени до тестирования, чтобы позволить рыбе приспособиться к присутствию исследователя. Успешной акклиматизации можно считать, когда рыба свободно исследует аквариум.
    1. Если рыба не может исследовать, продолжайте акклиматацию в течение дополнительных 15 минут. Если рыба все еще не может акклиматизироваться в челночном ящике, удалите рыбу. Не используйте эту рыбу для тестирования.
  5. Вручную светите 800-люменным красным объективом фонарика ~ 2 см от стенки гелевой коробки на стороне, занятой рыбой, после акклиматизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не начинайте испытание, если рыба лежит рядом с платиновой проволокой у стены возле глубоких концов челночной коробки.
  6. Наводите световой стимул непосредственно на рыбу и вручную следите за любым боковым движением рыбы светом, чтобы обеспечить непрерывную визуализацию стимула(рисунок 1C). Продолжайте предоставлять легкий стимул до тех пор, пока не будет выполнено одно из следующих условий.
    1. Считайте след успешным, если рыба пересекает половину аквариума в пределах 15 с воздействия света. Как только рыба пересечет половину пути, немедленно остановите световой стимул(рисунок 1D).
    2. Считайте тропу неудачной, если рыба не пересекает половину коробки за 15 с. В этом случае используйте электрофорезный источник питания для применения отрицательного шокового стимула (20 мВ:1 А), чередующего 2 с Вкл., 2 с Выкл. в течение 15 с (максимум 4 удара) или до тех пор, пока рыба не пройдет половину точки коробки, после чего прекратится как световой, так и отрицательный стимул.
  7. Дайте рыбе отдохнуть в течение 30 с и повторите шаг (этапы) 1.5-1.6.2. Ведите подробный учет порядка успешных испытаний (1.6.1) и неудачных испытаний (1.6.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы определили обучение как завершение 5 последовательных успешных испытаний. После того, как обучение было продемонстрировано, рыбу следует вынуть из челнока и гуманным образом усыпить.

2. Парадигма памяти(рисунок 1A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта парадигма обеспечивает оценку кратковременной и долговременной памяти усвоенной ассоциативной когнитивной задачи.

  1. Период обучения
    1. Добавьте 800 мл системной воды в челнок. Сделайте эту воду, растворив 60 мг Instant Ocean в 1 л деионизированной воды RO. Наполните воду до середины бака на глубину 5 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вода должна быть заменена пресной системной водой при 28 °C каждый час или после тестирования 3 рыб.
    2. Поместите 2-3 рыбы в резервуар для хранения, который содержит системную воду, расположенный в темном помещении, где будет проводиться анализ челночной коробки.
    3. В темной комнате поместите 1 рыбу в центр челночной коробки, закрепите крышку и прикрепите электроды к источнику питания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помещение должно оставаться как можно более темным во время акклиматизации и тестирования.
    4. Акклиматизировать рыбу в челноке в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь должен оставаться в комнате в течение периода акклиматизации или спокойно возвращаться в комнату для тестирования с достаточным количеством времени до тестирования, чтобы позволить рыбе приспособиться к присутствию исследователя. Определите успешную акклиматацию, когда рыба свободно исследует аквариум.
    5. Если рыба не может исследовать, продолжайте акклиматацию в течение дополнительных 15 минут. Если рыба все еще не может акклиматизироваться к челночному ящику, удалите рыбу и не используйте ее для тестирования.
    6. После успешной акклиматизации вручную светите 800-люменным красным фонариком с линзой ~ 2 см от боковой стенки гелевой коробки, на стороне челночной коробки, которая занята рыбой.
    7. Наводите световой стимул непосредственно на рыбу и следите за любым боковым движением рыбы светом, чтобы обеспечить постоянную визуализацию стимула рыбой.
    8. Пока свет светит на рыбу, одновременно применяйте неблагоприятный ударный стимул (20 мВ:1 А), чередуя 2 с Вкл,2 с Выкл в течение 15 с (максимум 4 удара) или до тех пор, пока рыба не пройдет половину точки коробки. Как только это будет достигнуто, прекратите как свет, так и неблагоприятный стимул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте рыбе отдохнуть в течение 30 с, затем повторите шаг 2.1.6-2.1.8 для 25 итераций(рисунок 1A).
  2. Первоначальное тестирование
    1. Дайте рыбе 15 минут отдыха после периода тренировки. Не снимайте их с челнока. Проверьте начальное сохранение памяти, записав каждое испытание как строго пройденный/неудачный, сразу после этого периода отдыха.
    2. Применяйте только световой стимул на срок до 15 с и записывайте ответы следующим образом.
      1. Считайте испытание успешным, если рыба пересекает половину челнока в течение 15 с после запуска светового стимула. Немедленно прекратите световой раздражитель, как только рыба пересечет половину пути.
      2. Считайте испытание неудачным, если рыба не пересекает половину пути челночной коробки через 15 с после запуска светового стимула. Остановите световой раздражитель через 15 с.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Во время первоначального тестирования неблагоприятный стимул не применяется после неудачной попытки.
    3. Повторите шаг 2.2.2 с периодом отдыха 30 с между испытаниями и запишите успешные испытания (2.2.2.1) и неудачные испытания (2.2.2.2) в 25 испытаниях. Это значение будет служить индивидуальным ориентиром для каждой рыбы.
  3. Мгновенная память
    1. Вызвать травму сразу после начального периода тестирования предпочтительной парадигмой повреждения (например, травма тупой силой с использованием модифицированного падения веса Мармару). Домашняя рыба индивидуально для легкой идентификации. Запишите их первоначальные значения испытаний и верните рыбу на объект для животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба была ранена тупой ЧМТ, как описаноранее 22.
    2. Соберите 2-3 неповрежденные или ЧМТ рыбы через 4 ч после первоначального тестирования и/или 4 ч после травмы (или в рассматриваемый экспериментальный период времени) из животного объекта. Держите всех рыб в темном помещении в отдельных резервуарах, содержащих системную воду.
    3. Поместите рыбу в центр челнока (приготовленную с помощью системной воды, как описано в 1.1), по одной рыбе за раз и закрепите крышку. Подключите блок питания и дайте рыбе акклиматизироваться в течение 15 минут.
    4. После акклиматизации оцените немедленную память (строго пройдите /не сдайте), применяя только световой стимул на срок до 15 с и запишите ответы следующим образом.
      1. Считайте испытание успешным, если рыба пересекает половину коробки в течение испытательного периода 15 с. Прекратите световой стимул при пересечении половины пути.
      2. Считайте испытание неудачным, если рыба не пересекает половину коробки в течение 15 с после начала светового стимула. Прекратите световой стимул после того, как 15-й период закончится.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого тестирования после травмы неблагоприятный шоковый стимул не применяется после неудачной попытки.
    5. Повторите шаг 2.3.4 с периодом отдыха 30 с между испытаниями и запишите количество успешных испытаний (2.3.4.1) и неудачных испытаний (2.3.4.2) в 25 испытаниях.
    6. Рассчитайте процентную разницу в успешных испытаниях после травмы до начального периода тестирования, используя уравнение:
      Equation 1
  4. Задержка памяти
    1. Возврат рыб, размещенных индивидуально для легкой идентификации и регистрации их первоначальных испытательных значений, на животное оборудование сразу после начального периода тестирования.
    2. Дайте рыбе 4 дня (или экспериментальные временные рамки, о которые идет речь) между первоначальным тестированием и травмой и / или отложенным тестированием памяти.
    3. Вызвать травму с помощью предпочтительной парадигмы повреждения (например, модифицированное падение веса Мармару, чтобы вызвать травму тупой силы). Размещайте рыбу индивидуально для легкой идентификации первоначальных значений тестирования и возвращая рыбу на животное оборудование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба была ранена тупой ЧМТ, как описаноранее 22.
    4. Соберите 2-3 неповрежденные или ЧМТ рыбы через 4 ч после первоначального тестирования и/или 4 ч после травмы (или в рассматриваемый экспериментальный период времени) из животного объекта.
    5. Держите всех рыб в темном помещении в отдельных резервуарах, содержащих системную воду, и размещайте по одной в центре челночной коробки (подготовленной с помощью системной воды, как описано в 1.1), закрепите крышку, подключите источник питания и дайте рыбе 15 минут акклиматизироваться.
    6. После акклиматизации оцените немедленную память (строго пройдите/не сдайте), применяя только световой стимул на срок до 15 с и запишите следующие реакции:
      1. Считайте след успешным, если рыба пересекает половину коробки в течение 15-го испытательного периода. Прекратите световой стимул при пересечении половины пути.
      2. Считайте след неудачным, если рыба не пересекает половину точки коробки в течение 15 с от начала светового стимула, прекратит световой стимул.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого тестирования после травмы неблагоприятный шоковый стимул не применяется после неудачной попытки.
    7. Повторите шаг 2.4.6 с периодом отдыха 30 с между испытаниями и запишите количество успешных испытаний (2.4.6.1) и неудачных испытаний (2.4.6.2) в 25 испытаниях.
    8. Рассчитайте процентную разницу в успешных испытаниях после травмы к начальному периоду тестирования с помощью уравнения:
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Парадигма обучения, изложенная в протоколе и схеме(рисунок 1),обеспечивает быструю оценку познания по отношению к ассоциативному обучению. Кроме того, эта парадигма имеет высокий уровень жесткости, определяя обучение как повторяющееся и последовательное проявление 5 последовательных положительных испытаний. Эта парадигма также применима к различным возрастным возрастам и травмам. Неповрежденная рыба в 8 месяцев (молодая взрослая особь), 18 месяцев (взрослая особь среднего возраста) и 24 месяца (взрослая особь) требовалось одинаковое количество испытаний, чтобы научиться избегать красного света (неповрежденная 8 м: 15,28 ± 4,92 испытания, 18 м: 17,66 ± 5,5 испытаний, 24 м: 16,2 ± 4,79 испытания, 8 м против 18 м p = 0,92, 8 м против 24 м p = 0,98, 18 м против 24 м p=0,97, рисунок 2A). Мы также использовали тяжелую черепно-мозговую травму тупой силы (STBI) модели22 и заметили, что рыбам в разном возрасте требовалось одинаковое количество испытаний для освоения анализа в течение 1-5 дней после травмы (dpi; 8 м против 18 м, p = 0,09, 8 м против 24 м, p = 0,96, 18 м против 24 м, p = 0,12, рисунок 2A). На 1-й день после ЧМТ рыбам всех возрастов (8, 18 и 24 м) требовалось аналогичное количество испытаний, чтобы научиться поведению (8 м: 73,3 ± 9,45 испытаний, 18 м: 79,33 ± 6,35 испытания, 24 м: 68,25 ± 6,65 испытания, 8 м против 18 м p=0,71, 8 м против 24 м p=0,76, 18 м против 24 м p=0,28, Рисунок 2A) и все они были значительно больше, чем неповрежденные контрольные элементы (стр<0,01). В совокупности эти данные демонстрируют, что челнок может быть использован для изучения когнитивного дефицита, вызванного травмой, в разных возрастных диапазонах и предполагают, что взрослые рыбки данио могут когнитивно восстанавливаться после травмы тупой силой.

Поскольку повторяющиеся события миТМ могут все больше ухудшать когнитивные функции, мы использовали анализ челночной коробки в качестве метрики для отслеживания дозозависимого прогрессирования с использованием повторяющейся ЧМТ. Мы использовали этот анализ для оценки обучения после травмы тупой силыmiTBI 22, которая повторяется ежедневно в течение разных промежутков времени. Как отмечалось ранее, неповрежденные рыбы быстро освоили челнок, достигнув 5 последовательных положительных испытаний в 16,4 ± 3,5 испытаниях(рисунок 2B). Через день после одного миТМ рыбы демонстрируют значительное увеличение числа испытаний для изучения поведения (40,25 ± 12,65 испытаний, стр<0,05, рисунок 2B). Этот дефицит увеличился после 2 событий miTBI (48 ± 14,9 испытаний) и был дополнительно повышен после 3 травм miTBI (56,63 ± 12,75 испытаний, рисунок 2B). Кроме того, мы наблюдали значительное увеличение когнитивных нарушений между рыбами миТМТ, которые получили единичную травму, и 3 травмами (стр<0,05).

Мы также изучили, как память была затронута после повторяющихся событий miTBI с использованием протокола для парадигм немедленной и отложенной памяти(рисунок 1A). Наивным неповрежденным рыбам был предоставлен период обучения и начальный период тестирования, после чего часть рыбы была повреждена для немедленной памяти, а другие были возвращены на рыбный объект на 4 дня для доступа к отсроченной памяти(рисунок 2C). Неповрежденные рыбы демонстрируют небольшое увеличение процентной разницы успешных испытаний как в непосредственной памяти (6,22% ± 4,7%), так и в задержке памяти (6,13% ± 5,57%) по сравнению с начальным периодом тестирования. Затем мы изучили влияние многочисленных событий тупой ЧМТ на память. Значительный дефицит наблюдался после миТМ в непосредственной памяти, но не в замедленной памяти. После одного миТМ рыба продемонстрировала значительный немедленный дефицит памяти (-26,77% ± 8,93%) по сравнению с неповрежденными рыбами (p<0,0001, рисунок 2C). Эта тенденция продолжилась с повторными травмами с увеличением дефицита после 2x miTBI (-37,42% ± 10,01%) и 3x miTBI (-39,71% ± 11,39%). Кроме того, мы наблюдали аналогичный дозо-эффект между рыбами, обработанными однократной (1x) миТМТ и 3x миТМТ (p<0,05, рисунок 2C). Эти данные свидетельствуют о том, что обучение и память снижаются у рыб с миТБ С увеличением числа травм, значительно увеличивая дефицит, а анализ челнока и протоколы, описанные выше, достаточно чувствительны, чтобы обнаружить эти различия.

Figure 1
Рисунок 1:Анализ шаттла. (A) Учебный обзор парадигм обучения и памяти для когнитивной оценки. (B) Схема преобразованной большой коробки с гелем ДНК для анализа челночной коробки. (С,D) Графическое представление применения стимулов во время испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Рыбки данио демонстрируют когнитивный дефицит после тупой ЧМТ. (A)После РТМТ рыбки данио в возрасте 8, 18 и 24 месяцев демонстрируют дефицит обучения, который существенно не отличается между возрастными группами. Значительное увеличение числа испытаний по изучению парадигмы шаттлов по сравнению с контрольной точки зрения, соответствующей возрасту, наблюдалось при возврате 1 dpi к неповрежденным уровням на 4-5 dpi. (В,В) Повторные миТМТ рыбы демонстрировали как обучение(B),так и дефицит памяти(C)в зависимости от дозы. Среднее ± SEM построено в A и B, в то время как среднее ± стандартного отклонения построено в C. Каждая точка данных на всех трех графиках представляет одну взрослую рыбку данио. Статистический анализ проводился либо с односторонним, либо с двусторонним ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест Tukey. # с<0.05, ## п<0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Когнитивные нарушения могут существенно и негативно повлиять на качество жизни. Из-за повышенной видимости и возникновения сотрясений и черепно-мозговых травм среди населения важно понимать, как они вызывают когнитивные нарушения и как ущерб может быть сведен к минимуму или обращен вспять. По этим причинам модельные организмы, которые могут быть проверены на снижение когнитивных функций, играют решающую роль в этих исследованиях. Грызуны уже давно являются основной моделью для исследования нейроповедения и познания, однако рыбки данио стали полезной моделью с многочисленными различными моделями поведения для исследования ряда развивающихся, возрастных и приобретенных когнитивных дефицитов17,20,23,24,25,26. Различные методы оценки познания были использованы от одномерного обучения в форме привыкания до сложного обучения и пространственной памяти, распознавания новых объектов и местоположения и принятиярешений 18,19,20,21,27,28. Тем не менее, эти когнитивные тесты ограничены тестированием неассоциативного познания или требуют сложной настройки, финансовых инвестиций в оборудование или длительных временных обязательств перед выполнением тестов. Напротив, челнок и парадигмы обучения и памяти, описанные здесь, используют сложный ассоциативный анализ обучения, который является экономически эффективным, быстро оценивается и легко используется начинающим исследователем. Самое главное, что в соответствии с другими когнитивными тестами, наш анализ показывает, что неповрежденные рыбы быстро осваивают ассоциативную задачу и могут запоминать задачу через несколько дней без прерывистой тренировки29.

Адаптивность анализа дает возможность исследовать различные временные точки обучения и памяти в качестве метрики прогрессирования заболевания или механистических вмешательств. Есть две основные особенности анализа. Во-первых, метод прост. Анализ быстро устанавливается и имеет четкие и четкие конечные точки в отношении успешных и неудачных испытаний, что делает его доступным для целого ряда исследователей. Мы обнаружили, что из-за простоты этого анализа для успешного использования шаттла требуется очень мало устранения неполадок. Во-вторых, анализ чрезвычайно быстрый по сравнению с другими когнитивными экзаменами, что обеспечивает гибкость или возможность быстро исследовать большое количество рыб за один день. Время оценки обучения составляет не менее 19,75 мин(рисунок 1),при этом рыбе требуется 15 минут для акклиматизации к челночному ящику (определяется исследованием резервуара), за которым следует одно неудачное испытание (световой стимул 15 с, стимул отвращения 15 с, 30 с между испытаниями) и 5 немедленных и последовательных положительных испытаний (световой стимул <15 с). На практике мы заметили, что неповрежденные рыбы требуют 6-30 испытаний (19,75 мин-43,75 мин), в то время как в крайних случаях (после тяжелой травмы тупой силой) наиболее тяжелые дефициты могут потребовать 100 испытаний (113,75 мин). Исследования памяти также быстро выполняются. Следуя протокольной схеме, минимальное время, необходимое для акклиматизации, обучения и первоначального тестирования, составляет 67,5 мин (15 мин акклиматизации, 25 итераций света и удара в течение 15 с, 30 с отдыха между испытаниями и повтор для первоначального тестирования без неблагоприятных стимулов). При повторном тестировании немедленной или замедленной памяти требуется всего 33,75 мин (15 мин акклиматизации, 25 итераций только светового стимула в течение 15 с и 30 с отдыха между испытаниями), независимо от травмы, лечения или когнитивного дефицита.

При оценке нейроповедения различные парадигмы используют либо положительные, либо неблагоприятные стимулы. Позитивные стимулы в виде пищи или социального взаимодействия, часто используемые в классических лабиринтах T-box, могут помочь в сильном ответе на выученные задачи. Тем не менее, анализы, использующие положительную ассоциацию, делают это за счет времени. Напротив, в то время как обусловливание в ответ на неблагоприятный стимул обеспечивает быструю ассоциацию и сильную поведенческую реакцию, это происходит за счет неблагоприятного стимула. Неповрежденные рыбы часто быстро осваивают анализ челнока и поэтому подвергаются минимальному количеству ударов, и в результате, по-видимому, не имеют побочных эффектов. Тем не менее, неврологически скомпрометированная рыба (ЧМТ) с тяжелым когнитивным дефицитом требует значительного количества испытаний и поражения электрическим током. Было замечено, что эти множественные шоки иногда приводят к тонико-клоническим судорогам. Любая рыба, испытывающая тонико-клонический припадок, находясь в челночном ящике, должна быть немедленно удалена и этически усыплена. Все испытания усыпленной рыбы, вплоть до случая изъятия, должны быть исключены из любого статистического анализа. Кроме того, стоит отметить, что удар электрическим током неврологически поврежденного субъекта может наложить непреднамеренные различия между поврежденными рыбами, которые являются и не являются результатом коробки челнока. По этой причине мы предлагаем всем рыбам, подвергаемым оценке нейроповедения, не использоваться для какой-либо другой количественной метрики (биомаркер сыворотки, IHC и т. Д.). Также важно понимать, что этот метод обучения основан на визуальном стимуле и не подходит для повреждений, которые могут поставить под угрозу зрительные цепи, поскольку это смущает результаты.

Наши результаты показывают, что после ЧМТ тупой силы рыбки данио демонстрируют быстрый когнитивный дефицит, что приводит к увеличению испытаний по освоению ассоциативной задачи в анализе челночной коробки. Аналогичные непосредственные дефициты наблюдаются в грызуновых моделях ЧМТ, однако эти дефициты могут уменьшаться, они часто сохраняются и остаютсязначительными 30. Напротив, рыбки данио демонстрируют когнитивное восстановление в течение 7 дней после травмы. Регенеративная способность взрослой рыбки данио хорошо документирована9,10,11,12,13,14,15,с известными нейрогенными нишами в желудочковой/субвентрикулярной зонах теленцефалона31,32. Когнитивное восстановление, наблюдаемое в нашем анализе после ЧМТ, дает представление о необходимых экзаменах, чтобы определить, стимулируются ли эти нейрогенные ниши и играют ли роль в восстановлении тканей и когнитивных функций.

В заключение, челнок обеспечивает быструю оценку познания в отношении ассоциативного обучения и памяти. Анализ использует минимальное и конвентуальное оборудование и технически прост. Будущие приложения могут быть использованы для оценки генетических и фармакологических вмешательств неврологически оскорбленных рыб в отношении нейропротекции, а также других парадигм травм или нейродегенеративных моделей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Хайда за их вдумчивые дискуссии и техников Центра наук о жизни Фрайманна по уходу за рыбками данио и их разведением. Эта работа была поддержана Центром исследований рыбок данио в Университете Нотр-Дам, Центром стволовых клеток и регенеративной медицины в Университете Нотр-Дам, а также грантами Национального института глаз NIH R01-EY018417 (DRH), Программы стипендий для аспирантов Национального научного фонда (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Стипендия Стражей Свободы (JTH) и Стипендия Пэта Тиллмана (JTH). Рисунок 1 выполнен с BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flashlight Ultrafire 9145
Instant Ocean Instant Ocean SS15-10
Large DNA Gel Box Fisher Scientific FB-SB-1316 Shuttle Box
Power Supply Fisher Scientific FB-105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
  2. Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
  3. Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
  4. Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
  5. Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
  6. Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L. The epidemiology of traumatic brain injury. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 25, 72-80 (2010).
  7. Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
  8. GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
  9. Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
  10. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
  11. Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
  12. Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
  13. Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
  14. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
  15. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
  16. Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
  17. Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  18. Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
  19. López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
  20. Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
  21. Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
  22. Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  23. Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
  24. Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
  25. Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
  26. Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V. Cognitive aging in zebrafish. PloS One. 1 (1), 14 (2006).
  27. Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
  28. Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
  29. Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
  30. Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
  31. Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  32. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).

Tags

Неврология Выпуск 173 Рыбки данио регенерация черепно-мозговая травма травма тупой силы обучение память
Shuttle Box Assay как ассоциативный инструмент обучения для когнитивной оценки в обучении и исследованиях памяти с использованием взрослых рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hentig, J., Cloghessy, K., Hyde, D.… More

Hentig, J., Cloghessy, K., Hyde, D. R. Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (173), e62745, doi:10.3791/62745 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter