작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화
Summary
기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.
Abstract
망막 신경 광 반응의 측정은 건강한 망막의 생리학을 조사하고, 망막 질환의 병리학 적 변화를 결정하고, 치료 적 개입을 테스트하는 데 중요합니다. 생체 외 망막 전도(ERG)를 사용하면 특정 약리학적 제제를 추가하고 전신 영향과 독립적으로 조직 내재적 변화를 평가하여 분리된 망막의 개별 세포 유형에서 기여도를 정량화할 수 있습니다. 망막 광 반응은 기존 패치 클램프 또는 미세 전극 어레이 장비에서 수정된 특수 생체 외 ERG 시편 홀더 및 기록 설정을 사용하여 측정할 수 있습니다. 특히, ON- 양극성 세포뿐만 아니라 광 수용체에 대한 연구는 시간이 지남에 따라 생체 외 ERG에서 빛 반응의 느리지 만 점진적인 감소로 인해 방해를 받았다. 관류 속도 증가 및 관류액 온도 조정은 생체 외 망막 기능을 향상시키고 응답 진폭과 안정성을 극대화합니다. 생체 외 ERG는 개별 망막 신경 세포 유형에 대한 연구를 독특하게 허용합니다. 또한 반응 진폭과 안정성을 최대화하기 위한 개선을 통해 대형 동물의 망막 샘플과 인간 기증자의 눈에서 빛 반응을 조사할 수 있으므로 생체 외 ERG는 망막 기능을 조사하는 데 사용되는 기술의 레퍼토리에 귀중한 추가 기능이 됩니다.
Introduction
전기 망막 촬영은 빛에 대한 반응으로 망막 기능을 측정합니다1. 망막 생리학 및 병태생리학을 연구하고 망막 질환 치료의 성공을 측정하는 데 필수적입니다. 생체 내 ERG는 손상되지 않은 유기체에서 망막 기능을 평가하는 데 널리 사용되지만 상당한 한계가 있습니다 2,3. 이 중 생체 내 ERG에서 개별 망막 세포 유형의 정량 분석은 모든 망막 세포에서 빛 자극4에 이르는 잠재적 변화의 합을 기록하고 따라서 반응을 오버레이하기 때문에 방해를 받습니다. 또한 망막에 약물을 쉽게 첨가 할 수 없으며 전신 영향에 취약하며 신호 대 잡음비가 상대적으로 낮습니다. 이러한 단점은 단리된 망막 2,3,5,6의 기능을 조사하는 생체외 ERG에서 제거된다. ex vivo ERG는 약리학적 억제제를 첨가하고 과염기에 첨가할 수 있는 치료제를 쉽게 평가하여 특정 망막 세포 유형에서 크고 안정적인 반응을 기록할 수 있습니다. 동시에 전신 효과의 영향을 제거하고 생리적 소음 (예 : 심장 박동 또는 호흡)을 제거합니다.
생체외 ERG에서, 망막 또는 망막 샘플은 단리되고, 시편 홀더(3,5)의 돔 상에 광수용체-측이 위로 향하도록 장착된다. 시편 홀더를 조립하고 망막에 가열되고 산소가 공급되는 매체를 공급하는 관류 시스템에 연결하고 컴퓨터로 제어되는 빛 자극을 전달하도록 수정된 현미경 스테이지에 놓습니다. 빛에 의해 유도된 응답을 기록하기 위해 시편 홀더는 증폭기, 디지타이저 및 기록 시스템에 연결됩니다(그림 1). 이 기술은 빛 자극의 매개 변수를 변경하고 약리학 적 약제를 추가하여 막대 및 원뿔 광 수용체, ON- 양극성 세포 및 Müller glia에서 반응을 분리 할 수 있습니다.
기존 패치 클램프 또는 다중 전극 어레이(MEA) 설정은 상용 생체 외 ERG 어댑터 또는 맞춤형 폴리카보네이트 컴퓨터 수치 제어(CNC) 가공 시편 홀더와 함께 생체 외 ERG를 기록하도록 변환하여 마우스와 같은 작은 동물 모델의 망막에서 광 반응을 측정할 수 있습니다. 이 수정은 생체 외 ERG의 접근성을 높이는 동시에 특수 장비의 필요성을 최소화합니다. 시편 홀더의 설계는 장착 기술을 단순화하고 전극을 통합하여 이전에 보고된 경망막 ex vivo ERG 방법7에 비해 미세 전극을 조작할 필요가 없습니다. 시편 홀더 내부의 관류 속도와 온도는 광 수용체와 ON- 양극성 세포의 반응 특성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 이러한 조건을 조정함으로써, 생체외 ERG는 장기간에 걸쳐 분리된 마우스 망막으로부터 신뢰성 있게 기록될 수 있다. 최적화된 실험 조건은 큰 동물의 눈과 인간 기증자의 눈을 포함한 더 큰 망막의 망막 펀치에서 생체 외 ERG 기록을 가능하게 합니다8.
Protocol
Representative Results
Discussion
원래 Holmgren이 양서류 망막10의 망막 빛 반응을 측정하기 위해 1865년에 개발한 이 제품은 기술적 제약으로 인해 ERG가 널리 사용되지 못했습니다. 그럼에도 불구하고 Ragnar Granit과 다른 사람들의 획기적인 연구는 ERG의 세포 기원을 확인하고 생체 외11,12,13에서 광 수용체 및 ON- 양극성 세포 반응을 측정했?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 National Eye Institute 보조금 EY02665 및 EY031706 및 국제 망막 연구 재단 Vinberg 박사, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), 실명 예방 연구, 뉴욕, 뉴욕, 유타 대학교 안과 및 시각 과학과에 대한 무제한 보조금. Frans Vinberg 박사는 또한 실명 예방 연구 / H. James 박사 및 Carole Free Career Development Award와 ARVO EyeFind 보조금의 Silke Becker 박사를 수상했습니다. 그림 2E에 표시된 기록에 사용되는 기증자 눈을 제공 한 스크립스 연구소의 Anne Hanneken 박사에게 감사드립니다.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
Riferimenti
- Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
