تحليل البلغم الذي يتم التحكم فيه بالجودة حسب قياس التدفق الخلوي
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لعدم ربط البلغم بتعليق خلية واحدة والتوصيف اللاحق للمجموعات الفرعية الخلوية على منصات قياس التدفق الخلوي القياسية.
Abstract
يتم تحليل البلغم ، الذي يستخدم على نطاق واسع لدراسة المحتوى الخلوي والميزات الأخرى للبيئة الدقيقة لفهم صحة الرئة ، تقليديا باستخدام منهجيات قائمة على علم الخلايا. فائدته محدودة لأن قراءة الشرائح تستغرق وقتا طويلا وتتطلب موظفين متخصصين للغاية. وعلاوة على ذلك، فإن الحطام الواسع النطاق ووجود عدد كبير جدا من الخلايا الظهارية الحرشفية ، أو خلايا الخد ، غالبا ما يجعل العينة غير كافية للتشخيص. وعلى النقيض من ذلك، يسمح قياس التدفق الخلوي بطباعة الخلايا ذات الإنتاجية العالية مع استبعاد الحطام ومركبات الكربون المستدامة في نفس الوقت.
يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة فعالة لتفكيك البلغم إلى تعليق خلية واحدة ، وصمة عار الأجسام المضادة وإصلاح المجموعات الخلوية ، والحصول على عينات على منصة قياس التدفق الخلوي. استراتيجية gating التي تصف استبعاد الحطام والخلايا الميتة (بما في ذلك الشركات الصغيرة والمتوسطة) ومزدوجات الخلية معروضة هنا. علاوة على ذلك ، يشرح هذا العمل أيضا كيفية تحليل خلايا البلغم الواحدة القابلة للتطبيق استنادا إلى مجموعة من التمايز (CD)45 مجموعات سكانية إيجابية وسلبية لتوصيف مجموعات فرعية من النسب الدموي والظهاري. كما يتم توفير مقياس لمراقبة الجودة من خلال تحديد الضامة الخاصة بالرئة كدليل على أن العينة مشتقة من الرئة وليست لعابا. وأخيرا، فقد ثبت أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على منصات مختلفة من خلال توفير ملامح البلغم من نفس المريض تحليلها على ثلاثة مقاييس تدفق الخلايا. نافيوس EX، LSR الثاني، ولريك. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل علامات خلوية إضافية ذات أهمية. يتم تقديم طريقة لتحليل عينة البلغم بأكملها على منصة قياس التدفق الخلوي هنا التي تجعل البلغم قابلا لتطوير تشخيص عالي الإنتاجية لمرض الرئة.
Introduction
وقد أتاحت التطورات التقنية في أجهزة وبرامج مقاييس التدفق الخلوي تحديد العديد من مجموعات الخلايا المتميزة في وقت واحد1,2,3,4. على سبيل المثال، أدى استخدام مقياس التدفق الخلوي في أبحاث الخلايا الدموية إلى فهم أفضل بكثير للجهاز المناعي2 والتسلسل الهرمي الخلوي للنظام الدموي(5)، فضلا عن التمييز التشخيصي للعديد من أنواع سرطان الدم المختلفة6,7,8. على الرغم من أن معظم خلايا البلغم هي من أصل دموي9,10,11, لم يتم تطبيق قياس التدفق الخلوي على نطاق واسع لتحليل البلغم لأغراض التشخيص. ومع ذلك، تشير العديد من الدراسات إلى أن تقييم مجموعات الخلايا المناعية في البلغم (أهم مجموعة فرعية من الخلايا) قد يكون عونا كبيرا في تشخيص و/أو مراقبة أمراض مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)12,13,14,15. وعلاوة على ذلك، فإن وجود علامات خاصة بالظهارية التي يمكن استخدامها في قياس التدفق الخلوي يسمح باستجواب المجموعة الفرعية التالية الأكثر أهمية من الخلايا في البلغم، خلايا ظهارية الرئة.
بالإضافة إلى القدرة على تحليل العديد من مجموعات الخلايا المتميزة من أصول أنسجة مختلفة ، يمكن لقياس التدفق أن يقيم أعدادا كبيرة من الخلايا في فترة قصيرة نسبيا. وبالمقارنة، فإن أنواع التحليلات المستندة إلى الشرائح والسيكلوتية كثيرا ما تتطلب موظفين و/أو معدات عالية التخصص. يمكن أن تكون هذه التحليلات كثيفة العمالة ، مما يؤدي إلى تحليل نسبة فقط من عينة البلغم16.
تحد ثلاث قضايا حرجة من الاستخدام الواسع النطاق للسبيتوم في قياس التدفق الخلوي. تتعلق المشكلة الأولى بمجموعة البلغم. يتم جمع البلغم من خلال سعال النفخ الذي يطرد المخاط من الرئتين إلى تجويف الفم ، ويبصق لاحقا في كوب جمع. منذ المخاط يسافر من خلال تجويف الفم، وهناك فرصة كبيرة للتلوث SEC. هذا التلوث يعقد تحليل العينة ، ولكن يتم تصحيح المشكلة بسهولة على منصة قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح في هذه الدراسة.
ليس كل شخص يمكن أن تنتج البلغم تلقائيا; لذلك ، تم تطوير العديد من الأجهزة للمساعدة في جمع البلغم بطريقة غير الغازية17. البخاخات هو واحد من هذه الأجهزة، وقد ثبت لإنتاج عينات البلغم موثوق بها18,19,20. على الرغم من أن البخاخات هي وسيلة فعالة جدا لجمع البلغم غير الغازية ، إلا أن استخدامه لا يزال يتطلب إعدادا في منشأة طبية مع موظفين متخصصين21. في المقابل، يمكن استخدام الأجهزة المحمولة مثل الناي الرئة22,23,24 و acapella16,25 في المنزل لأنها سهلة الاستخدام للغاية. هذه الأجهزة مساعدة على حد سواء آمنة وفعالة من حيث التكلفة.
بالنسبة لنا، أعطى أكابيلا نتائج أفضل باستمرار من الناي الرئة16، وبالتالي، تم اختيار جهاز أكابيلا لمجموعات البلغم. تم تحديد عينة جمع لمدة 3 أيام لأن الغرض الأساسي لاستخدام البلغم هو تطوير اختبار الكشف عن سرطان الرئة16. وقد تبين أن عينة لمدة 3 أيام يزيد من احتمال الكشف عن سرطان الرئة مقارنة مع عينة 1-أو 2-يوم26,27,28. ومع ذلك، قد تكون أساليب أخرى لجمع البلغم الأفضل لأغراض مختلفة. إذا تم استخدام طريقة مختلفة لجمع البلغم من تلك الموصوفة هنا ، فمن المستحسن أن تثن بعناية كل الأجسام المضادة أو الصبغة المستخدمة لتحليل تدفق القياسات الخلوية ؛ تتوفر بيانات قليلة جدا حول كيفية تأثير طرق جمع البلغم المختلفة على البروتينات المستهدفة لقياس التدفق الخلوي.
القضية الثانية التي تقلل من الحماس لاستخدام البلغم للتشخيص ، تتعلق في المقام الأول بتدفق قياس الخلايا ، هو رقم الخلية. المشكلة هي جمع خلايا كافية قابلة للحياة لتحليل موثوق بها. أظهرت دراستان أن عينات البلغم التي تم جمعها بطرق غير جراحية ، بمساعدة جهاز مساعدة ، تحتوي على ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة التي يمكن استخدامها في التشخيص السريري أو الدراسات البحثية16،24. ومع ذلك، لم تتناول أي من هاتين الدراستين مسألة أرقام الخلايا المتعلقة ب قياس التدفق الخلوي.
بالنسبة للدراسات التي تشكل الأساس لهذا البروتوكول، تم جمع عينات البلغم من المشاركين المعرضين لخطر كبير للإصابة بسرطان الرئة باتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة لكل موقع دراسة. تم تعريف المشاركين المعرضين لخطر كبير على أنه بين 55-75 سنة ، بعد أن دخنوا 30 عاما ولم يقلعوا عن التدخين خلال السنوات ال 15 الماضية. وقد تبين للمرضى كيفية استخدام جهاز أكابيلا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة29 وجمع البلغم لمدة ثلاثة أيام متتالية في المنزل. تم الاحتفاظ بالعينة في الثلاجة حتى المجموعة الأخيرة. وفي يوم الجمع الأخير، شحنت العينة إلى المختبر طوال الليل مع حزمة باردة مجمدة. وقد عولجت العينات لتصبح تعليقا لزنزانة واحدة في اليوم الذي وردت فيه. مع هذه الطريقة لجمع البلغم، يتم الحصول على أكثر من ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة لتحليل التدفق الخلوي موثوق بها.
وأخيرا، والمتعلقة المشكلة رقم الخلية السابقة، هو السؤال عن كيفية تحرير خلايا البلغم من بيئتها mucinous. كيف يمكن الحفاظ على الخلايا قابلة للحياة وخلق تعليق خلية واحدة لا تسد مقياس التدفق الخلوي؟ استنادا إلى العمل الأولي من قبل Pizzichini et al.30 و Miller et al.31 ، يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وموثوقة لمعالجة البلغم في تعليق خلية واحدة مناسبة لتحليل التدفق الخلوي. وقد استخدمت هذه الطريقة مبادئ توجيهية راسخة في تدفق الخلايا32,33,34 لوضع استراتيجية فعالة لوضع العلامات على الأجسام المضادة لتحديد الخلايا الدموية والظهارية في البلغم وتوفير إعدادات الأداة، وتدابير مراقبة الجودة، والمبادئ التوجيهية للتحليل توحيد تحليل البلغم على منصة تدفق الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتضمن المحتوى الخلوي للسبيتوم مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا واسعة النطاق ، غالبا ما يرافقها الكثير من الحطام37. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تحليل البلغم مراقبة الجودة التي تؤكد أن العينة يتم جمعها من الرئة بدلا من تجويف الفم38. لذلك ، فإنه ليس من السهل تحليل البلغم ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر ديفيد رودريغيز على مساعدته في إعداد الرقم. تم تشغيل عينات البلغم على BD LSR II في مرفق الموارد المشتركة لقياس الخلايا في UT Health San Antonio Flow ، بدعم من UT Health و NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) وUL1 TR001120 (منحة CTSA).
Materials
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
Riferimenti
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), 739-740 (2015).
- Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
- Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
- Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), 475-478 (2000).
- Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), 1172-1174 (2000).
- Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
- Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
- Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
- Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
- Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
- Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
- Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
- Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
- Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
- Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
- Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
- Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
- Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
- Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
- Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
- Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
- . Smiths Medical Videos Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021)
- Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
- Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Kini, S. R. . Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , (2002).
- Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
- Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
- Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
- Armstrong-Hough, M., et al. “Something so hard”: a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
- Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
- Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
- Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
- Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
- Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
- Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
- Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), 420-423 (2010).
- Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), 516-527 (2018).
- Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
- Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -. M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
- Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
- Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).
