이미징 유래 평균 제곱 변위 (iMSD) 분석은 구조 및 동적 특성 측면에서 고유 한 시간 진화 특성을 강조하기 위해 매크로 피노솜에 적용됩니다. 그런 다음 Macropinosomes는 시간 불변의 평균 구조 / 동적 특성을 가진 세포 하부 구조에 대한 참조로서 인슐린 분비 과립 (ISGs)과 비교됩니다.
이미징 유래 평균 제곱 변위 (iMSD)는 용질 및 생체 분자의 endo / exocytotic trafficking에 관여하는 소포와 같은 세포 이하 나노 구조의 구조적 및 동적 특성을 해결하는 데 사용됩니다. iMSD는 표준 타임랩스 이미징에 의존하고, 모든 광학 설정과 호환되며, 궤적을 추출하기 위해 단일 오브젝트에 머무를 필요가 없습니다. 각각의 iMSD 트레이스로부터, 평균 구조 및 동적 파라미터(즉, 크기, 국소 확산도, 변칙 계수)의 고유한 삼중항이 계산되고 조합되어 연구중인 나노구조체의 “iMSD 시그니처”를 구축한다.
이 접근법의 효능은 매크로 피노솜의 모범적 인 사례로 여기에서 입증됩니다. 이 소포는 시간에 따라 진화하여 평균 크기, 수 및 동적 특성이 세포 내 밀매의 초기 단계에서 후기 단계로 넘어갑니다. 대조군으로서, 인슐린 분비 과립 (ISGs)은 개체의 전체 집단의 평균 구조적 및 동적 특성이 시간에 불변하는 정지 상태에 사는 아세포 구조에 대한 참조로 사용됩니다. iMSD 분석은 이러한 독특한 특징을 정량적으로 강조하고 생리 학적 및 병리학 적 상태 모두에서 하위 세포 수준에서 유사한 응용 프로그램에 대한 길을 열어줍니다.
세포하 나노구조체(예를 들어, 내시/분비 소포, 소기관)는 세포-신호전달 조절1에서 중추적인 역할을 한다. 그들의 구조적 (예를 들어, 크기) 및/또는 동적 (예를 들어, 확산성) 특성의 적절한 튜닝은 세포 가 내부 또는 외부 자극 2,3,4에 어떻게 반응하는지를 결정한다. 이 증거에 기초하여, 이러한 특성의 변화가 많은 병리학 적 조건에서 발견된다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 예는 암 2,3에서 잘못 조절된 엔도사이토시스의 역할, 제2형 당뇨병 상태5에 노출된 β-세포에서 ISGs의 수준에서 발견되는 구조적 및 동적 변화, 글로보이드-세포 백혈구 이영양증 또는 갈락토실세라미드 지질증에서의 리소좀 구조 및 수송 특성의 잘못된 조절, 및 신경 퇴행성 장애 (예를 들어, 알츠하이머병)7에서 엔도-리소좀 경로에서의 기능장애를 포괄한다.
이러한 맥락에서, 연구자들은 최근 표준 광학 현미경 방법의 성능이 공간 및 시간적 샘플링 분해능을 적절하게 튜닝함으로써 향상될 수 있음을 입증하였다8. 이것은 차례로 관련성의 생물학적 과정에 대한 더 많은 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 실제로, 이것은 시공간 변동 분석의 알고리즘에 의해 가능해지는데, 이는 관심있는 생물학적 대상에 대한 예비 지식과 단일 물체 궤적의 추출에 대한 예비 지식이 필요없이 광학 현미경 이미지의 표준 스택에서 직접 확산 물체의 평균 구조 및 동적 특성을 동시에 추출합니다. 이 모든 정보는 iMSD 추적9 (iMSD 추적 파생 및 분석에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 제공됨)라는 방법의 단일 출력으로 묶여 있습니다.
결과 실험 프로토콜은 몇 가지 단계로 구성됩니다. 첫째, 관심 영역의 이미징은 높은 시간 해상도로 수행됩니다. 그런 다음, 평균 공간적-시간적 상관 함수들이 이미지들의 스택으로부터 계산된다. 마지막으로, 일련의 상관 함수의 가우시안 피팅에 의해, 평균 ‘확산 법칙’은 이미징으로부터 직접 얻어지고 물체 확산 모드를 인식하기 위해 분석된다. 이 방법의 잠재력은 분자에서 나노 입자, 심지어 전체 세포 소기관 / 구조 9,10,11,12,13,14,15에 이르기까지 다양한 생물학적 개체에 대해 이미 입증되었습니다.
이 논문은 마크로 피노솜에 대한 iMSD 적용을보고하여 평균 (즉, 전체 인구 수준에서) 구조적 및 동적 특성의 관점에서 본질적이고 돌이킬 수없는 시간 진화 특성을 강조합니다. 또한, 이들 내시성 소포는 ‘정지 상태’, 즉 과립의 전체 집단의 평균 구조적/동적 특성이 임의의 시점에서 일정하게 유지되는 상태에서의 아세포 구조에 대한 기준으로서 ISGs와 비교된다. Macropinocytosis는 원형질막의 광범위한 재구성 (또는 주름 형성)에 의해 시작된 일련의 사건을 정의하여 외부 거대 피노사이틱 구조를 형성하고 그 후 내재화된다16. 형성된 초기 단계의 마크로피노좀은 파고솜과 매우 유사하다. 동시에, 그들은 특징적으로 큰 크기, 형태 학적 이질성 및 단백질 코트 구조의 부족으로 인해 다른 형태의 내시성 소포와 구별 될 수 있습니다.
생화학 적 분석은 내면화시 마크로 피노솜이 다른 내세포 경로의 단백질 마커로 점진적으로 풍부 해지고, 차례로 인신 매매17 동안 그들의 정체성이 지속적으로 변화하고 있음을 시사한다. 엔도솜 경로의 공지된 마커에 대한 항체를 사용하여, 마크로피노좀이 점진적으로 고전적인 엔도솜 특징을 채택한다는 것이 입증되었다: 그들은 크기가 감소하거나, 후기 내분비 구조 (예를 들어, 리소좀)로 발전하거나, 결국 특정 분자 마커의 막 매개 검색 (예를 들어, 넥신 분류)을 통해 그들의 동일성을 잃는다.18,19 . 전반적인 시나리오는 세포 내의 모든 단일 거대 피노솜이 원형질막에서 최종 세포 내 운명으로 밀매되는 동안 구조적, 역동적 (뿐만 아니라 분자적) 정체성을 돌이킬 수 없게 변화시킨다는 것입니다. 결과적으로, 거대 피노솜의 전체 집단의 구조적/동적/분자적 특성 또한 동일한 시간적 경로를 따라 변화하고 있다. 관찰된 개체의 전체 집단의 평균 특성에 본질적으로 민감하기 때문에, iMSD 방법은 주요 평균 파라미터, 즉 국소 확산성 및 변칙 계수(동적 특성) 및 그들의 세포내 밀매의 임의의 단계에서 마크로피노좀의 평균 크기(구조적 특성)의 정량화에 의해 ‘진화하는 자연’을 정량적으로 묘사한다.
비교를 위해, 유사한 측정이 잘 알려진 세포내 막-밀폐된 구조인 ISG에 대해, β-세포의 모델에서 수행되었다. 마크로피노좀과 마찬가지로, 트랜스골지 네트워크(TGN)에서의 그들의 기원으로부터 원형질막에서의 그들의 엑소사이토시스에 이르기까지, ISGs의 구조적 및 동적 특성의 조절은 ISG 기능(20)의 적절한 실행에 중추적이다. 그러나 마크로피노솜과는 달리, ISG는 ISG 수명의 모든 기능적/구조적/분자적 단계가 세포 내에 동시에 존재하고 각각은 ISG의 특정 하위 집단으로 표현되는 ‘정지 상태’에 살고 있다. 즉, 모든 단일 과립이 생물 발생에서 분비로 돌이킬 수 없게 진화하지만, 과립 전체 집단의 평균 구조 / 동적 특성은 언제든지 일정하게 유지 될 것으로 예상됩니다 (예를 들어 포도당, 콜레스테롤 및 사이토 카인13과 같은 외부 자극에 의해 고정 상태 조건이 변경되지 않는 한). 이것은 iMSD 분석에 의해 확인된다.
iMSD의 특성과 장점은 유사한 정보를 검색하는 데 사용할 수 있는 기술과 비교할 때 분명합니다. 구조 정보를 위해, 바람직한 선택은 투과 전자 현미경 (TEM) 분석이다. 이 방법에 의해, 분자 분해능 및 심지어 그 이상에서의 초구조적 세부 사항들이 심지어 세포내 나노구조체에 대해서도 검색될 수 있다. 그럼에도 불구하고, TEM의 독특한 공간 분해능은 시간적 차원의 정보를 희생시키면서 달성되며, 이는 여기서 흥미로울 만하다. 이를 보완하기 위해, 최근 라이브 셀 이미징 기술의 발전이 특히 중요합니다. 여기에는 향상된 성능(예를 들어, 밝기 및 광안정성)을 갖는 새로운 형광 마커, 최적화된 라벨링 절차, 및 보다 민감한 검출기가 포함된다. 또한, 분석 툴은 구조적(예를 들어, 로컬 이미지 상관 분광법의 페이저 기반 분석에 의한 ‘크기’, PLICS 23, Number&Brightness analysis(24)에 의한 응집/올리고머화) 및 동적(예를 들어, 단일 입자 추적에 의한 확산 법칙, 즉 (SPT)25,26,27,28 모두를 다루기 위해 이용가능하다. ) 아세포 스케일에 대한 파라미터. SPT 메서드는 개체 궤적 및 해당 MSD에 직접 액세스할 수 있습니다. 그러나, 단점은 낮은 밀도의 프로브 및 매우 밝은 라벨 및 통계적 기준을 만족시키기 위해 측정될 많은 단일 물체 궤적에 대한 필요성이다. 측정의 시간적 분해능과 관련하여, 무기물, 광감성 프로브(예를 들어, 양자점 또는 금속 나노입자)는 SPT 성능을 증가시킬 수 있지만 복잡한 생산 및 라벨링 절차를 희생한다.
이러한 표준과 비교하여 여기에 설명 된 iMSD 방법은 몇 가지 주요 이점을 보여줍니다. 첫째, 이러한 접근법은 유전적으로 코딩된 형광 단백질과 같은 비교적 희미한 형광 태그와 함께 사용될 수 있다(예를 들어, ISGs에 적용). 따라서, SPT와 비교하여, 요구되는 광자의 양이 적기 때문에(동일한 라벨을 사용하여) 더 높은 시간적 분해능이 달성된다(동일한 라벨 사용). 둘째, iMSD 방법은 시간 분해능에 의해서만 제한되지만 회절은 제한되지 않는다. 실제로, 회절-제한된 광학 셋업이 사용되었음에도 불구하고, STICS(29)를 사용하여 분자 흐름에 대해 이미 입증된 바와 같이, 회절 한계 미만에서도 평균 분자 변위가 측정될 수 있다. 변위 측정의 실제 분해능은 상관 함수가 얼마나 정확하게 (신호 대 잡음의 관점에서) 측정 될 수 있는지에 달려 있으며, 따라서 회절에 의해 제한되지 않는 이유를 설명합니다. 따라서, 측정될 수 있는 최소 변위가 관심 대상의 확산성 및 이미징 셋업의 시간적 해상도에 의존한다는 것이 명백하게 보인다.
이와 관련하여, 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 마크로피노좀 또는 인슐린 과립과 같은 세포하 나노구조체에 적용하는 것이 최적이라는 것을 고려하는 것이 중요하다: 이용 가능한 주사 속도는 관심 대상의 역학보다 상당히 높다. 이러한 경우, 획득 동안 물체의 이동은 무시할 수 있으며, 상관 함수는 가우시안 함수에 의해 근사화될 수 있다. 마지막으로, iMSD 접근 방식은 래스터 스캔 또는 광역 카메라 기반 이미징을 기반으로 하는 광범위한 상용 광학 현미경 설정에 쉽게 적용할 수 있으며, 시스템 보정이 필요하지 않습니다(입자 크기의 정확한 추정을 달성해야 하는 경우에만 필요함). 메서드가 작동하기 위한 중요한 매개 변수는 적절한 공간 샘플링입니다. 일반적으로 피팅 알고리즘의 만족스러운 수렴에 도달하려면 이미징을위한 관심 영역의 최소 크기가 관심 대상 최대 변위보다 적어도 3 배 커야합니다.
결론적으로, iMSD 방법은 빠른 수집을 위해 장착 된 현미경 만 있으면됩니다. 관심있는 구조는 임의의 유전적으로 인코딩된 또는 유기 형광단에 태깅될 수 있고, 따라서 다중 채널 이미징을 가능하게 한다. 가까운 장래에 교차 iMSD 분석이 세포 내 나노 구조의 하위 집단을 선택하고 세포 내에서 상호 작용과 공동 확산을 밝히는 데 사용될 것으로 예상되며, 후자는 세포 생물 물리학에서 뜨거운 주제입니다. iMSD 분석에 의해 어떤 세부 사항이 손실된다면, 이것은 확실히 동적 세포 내 나노 구조 내의 많은 양의 분자 정보와 관련이 있습니다. 이러한 정보는 필연적으로 열악한 시간 분해능으로 인해 측정 중에 평균화됩니다. 그러나 이론적으로는 충분한 획득 속도를 달성할 수 있다면 분자 정보를 검색할 수 있는 가능성으로 인해 기술적 한계가 없다8. 검출기 속도/감도 및 이미징 기술의 지속적인 개선으로 인해 전체 세포 하부 구획 및 분자 구성 요소에 대한 정보가 단일 데이터 세트에서 추출될 것으로 예상됩니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램 (보조금 계약 866127 없음, 프로젝트 CAPTUR3D)에 따라 유럽 연구위원회 (ERC)로부터 자금을 지원받았습니다.
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |