ננו-טיפות פרפלואורוקרבון המופעלות אופטית מראות הבטחה ביישומי הדמיה מחוץ למערכת כלי הדם. מאמר זה ידגים כיצד לסנתז חלקיקים אלה, להצליב פנטום פוליאקרילאמיד ולווסת את הטיפות באופן אקוסטי כדי לשפר את האות שלהם.
Microbubbles הם חומר ניגוד הדמיה הנפוץ ביותר באולטרסאונד. עם זאת, בשל גודלם, הם מוגבלים לתאי כלי הדם. מיקרו-בועות אלה יכולות להיות מרוכזות או מנוסחות כננו-טיפות פרפלואורוקרבון (PFCnDs) שהן קטנות מספיק כדי לחדור ואז להיות מופעלות אקוסטית באתר היעד. ניתן לשפר עוד יותר ננו-חלקיקים אלה על-ידי הכללת בולם אופטי כגון צבע אורגני אינפרה-אדום קרוב או ננו-חלקיקים (לדוגמה, ננו-חלקיקי נחושת גופרתית או ננו-חלקיקי זהב/ננו-רודים). ניתן לאדות PFCnDs המתויגים אופטית באמצעות הקרנת לייזר בתהליך המכונה אידוי טיפות אופטיות (ODV). תהליך הפעלה זה מאפשר שימוש בליבות פרפלואורוקרבון בנקודת רתיחה גבוהה, שלא ניתן לאדות אותן אקוסטית מתחת לסף האינדקס המכני המרבי להדמיית אבחון. ליבות גבוהות יותר של נקודות רתיחה גורמות לטיפות שיתעבו מחדש לאחר אידוי, וכתוצאה מכך “מהבהבות” PFCnDs שמייצרות ניגודיות לזמן קצר לאחר אידוי לפני שהן מתעבות בחזרה לצורת ננו-טיפות. ניתן לחזור על תהליך זה כדי לייצר ניגודיות לפי דרישה, מה שמאפשר הדמיה ללא רקע, ריבוי, רזולוציית-על ושיפור ניגודיות באמצעות אפנון אופטי ואקוסטי כאחד. מאמר זה ידגים כיצד לסנתז PFCnDs של מעטפת ליפידים הניתנים להפעלה אופטית תוך שימוש בסוניקציה של בדיקה, ליצור פנטומים פוליאקרילאמיד כדי לאפיין את הננו-טיפות, ולווסת אקוסטית את ה-PFCnDs לאחר ODV כדי לשפר את הניגודיות.
מיקרו-שבבים הם חומר הניגוד האולטרסאונד הנפוץ ביותר בשל תאימותם הביולוגית והאקוגניות המצוינת שלהם בהשוואה לרקמות רכות. זה הופך אותם לכלים חשובים להדמיית זרימת הדם, תיחום איברים ויישומים אחרים1. עם זאת, גודלם (1-10 מיקרומטר), מה שהופך אותם יוצאי דופן להדמיה בהתבסס על תדירות התהודה שלהם, מגביל את היישומים שלהם לכלי הדם2.
מגבלה זו הובילה לפיתוח PFCnDs, שהם ננו-אמולסיות המורכבות מחומר פעילי שטח העטופים סביב ליבת פרפלואורוקרבון נוזלית. ננו-חלקיקים אלה יכולים להיות מסונתזים בגדלים של עד 200 ננומטר והם מתוכננים לנצל את כלי הדם או הנקבוביות “דולפים” ואת הפנסטרציות הפתוחות הנמצאות בכלי הדם של הגידול. בעוד ששיבושים אלה תלויים בגידול, חדירות זו מאפשרת אקסטרווזיה של ננו-חלקיקים מ~200 ננומטר – 1.2 מיקרומטר בהתאם לגידול 3,4. בצורתם הראשונית, חלקיקים אלה מייצרים ניגודיות אולטרסאונד מועטה עד אפסית. עם אידוי – המושרה אקוסטית או אופטית – פאזת הליבה משתנה מנוזל לגז, מה שגורם לעלייה של פי שניים וחצי עד פי חמישה בקוטר 5,6,7 ויוצר ניגודיות פוטואקוסטית ואולטרסאונד. בעוד אידוי אקוסטי הוא שיטת ההפעלה הנפוצה ביותר, גישה זו יוצרת ממצאים אקוסטיים המגבילים את הדמיית האידוי. בנוסף, רוב הפרפלואורוקרבונים דורשים אולטרסאונד ממוקד עם אינדקס מכני מעבר לסף הבטיחות כדי לאדות8. זה הוביל לפיתוח של PFCnDs נקודת רתיחה נמוכה יותר, אשר ניתן לסנתז על ידי עיבוי microbubbles לתוך ננוטיפות9. עם זאת, טיפות אלה הן תנודתיות יותר וכפופות לאידוי ספונטני10.
אידוי טיפות אופטי (ODV), לעומת זאת, דורש תוספת של הדק אופטי כגון ננו-חלקיקים 11,12,13 או צבע 6,14,15 ויכול לאדות פרפלואורוקרבונים גבוהים יותר של נקודת רתיחה באמצעות פלואנציות בתוך מגבלת הבטיחות של ANSI 11. PFCnDs מסונתזים עם ליבות נקודת רתיחה גבוהות יותר הם יציבים יותר ויתעבו מחדש לאחר אידוי, מה שמאפשר הדמיה ללא רקע16, ריבוב 17 וסופר-רזולוציה18. אחת המגבלות העיקריות של טכניקות אלה היא העובדה כי PFCnDs נקודת רתיחה גבוהה הם אקוגניים לאחר אידוי למשך פרק זמן קצר בלבד, בקנה מידה שלאלפיות השנייה 19, והם קלושים יחסית. בעוד שניתן למתן בעיה זו באמצעות אידויים חוזרים ונשנים וממוצע, זיהוי והפרדה של אות טיפה נותר אתגר.
בהשראת היפוך הדופק, ניתן לשפר את משך הזמן והניגודיות על ידי שינוי השלב של דופק הדמיית האולטרסאונד19. על ידי הפעלת פולס הדמיית האולטרסאונד עם פאזה נדירה (n-pulse), הן משך הזמן והן הניגודיות של PFCnDs התאדה גדלים. לעומת זאת, הפעלת פולס הדמיית האולטרסאונד בשלב דחיסה (p-pulse), מביאה לניגודיות מופחתת ולקיצור משך הזמן. מאמר זה יתאר כיצד לסנתז ננו-טיפות פרפלואורוקרבון הניתנות להפעלה אופטית, פנטום פוליאקרילאמיד הנפוץ בהדמיה, ולהדגים שיפור ניגודיות ואורך חיים משופר של האות באמצעות אפנון אקוסטי.
סוניקציה של בדיקה היא שיטה פשוטה יחסית וקלה ללמידה לייצור PFCnDs. ישנם כמה צעדים שבהם יש לנקוט בזהירות. כאשר מטפלים בכלורופורם, זה הכרחי כי פיפטה עקירה חיובית או מזרקי זכוכית משמש, כפי שהוא נדיף יהיה “לדלוף” מן פיפטות תזוזה אוויר סטנדרטי. יתר על כן, אם משתמשים בתזוזה חיובית, ודא כי קצה מתאים משמ?…
The authors have nothing to disclose.
העבודה נתמכה בחלקה על ידי הקרן לחקר סרטן השד תחת מענק BCRF-20-043.
Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
L11-4v | Verasonics | – | ultrasound linear array transducer |
Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
Tempest 30 | New wave research | – | Pulsed laser system |
Vantage 128 | Verasonics | – | research ultrasound imaging system |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | – | Makes size measurements based on dynamic light scattering |