Formulering en akoestische modulatie van optisch verdampte perfluorkoolstof nanodruppels

Summary

Optisch geactiveerde perfluorkoolstof nanodruppeltjes zijn veelbelovend in beeldvormingstoepassingen buiten het vasculaire systeem. Dit artikel zal demonstreren hoe deze deeltjes te synthetiseren, polyacrylamidefantooms te crosslinken en de druppels akoestisch te moduleren om hun signaal te verbeteren.

Abstract

Microbubbels zijn het meest gebruikte beeldcontrastmiddel in echografie. Vanwege hun grootte zijn ze echter beperkt tot vasculaire compartimenten. Deze microbubbels kunnen worden gecondenseerd of geformuleerd als perfluorkoolstof nanoddruppeltjes (PFCnD’s) die klein genoeg zijn om te extravaseren en vervolgens akoestisch worden geactiveerd op de doellocatie. Deze nanodeeltjes kunnen verder worden verbeterd door een optische absorber op te nemen, zoals nabij-infrarode organische kleurstof of nanodeeltjes (bijv. Kopersulfide nanodeeltjes of gouden nanodeeltjes / nanostaafjes). Optisch gelabelde PFCnD’s kunnen worden verdampt door laserbestraling in een proces dat bekend staat als optische druppelverdamping (ODV). Dit activeringsproces maakt het gebruik van perfluorkoolstofkernen met een hoog kookpunt mogelijk, die niet akoestisch kunnen worden verdampt onder de maximale mechanische indexdrempel voor diagnostische beeldvorming. Hogere kookpuntkernen resulteren in druppels die na verdamping opnieuw worden samengesteld, wat resulteert in “knipperende” PFCnD’s die kort contrast produceren na verdamping voordat ze terug condenseren in nanodruppelvorm. Dit proces kan worden herhaald om contrast op aanvraag te produceren, waardoor de achtergrondvrije beeldvorming, multiplexing, superresolutie en contrastverbetering mogelijk is door zowel optische als akoestische modulatie. Dit artikel zal demonstreren hoe optisch-triggerbare, lipide shell PFCnD’s kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van sonde-sonicatie, polyacrylamidefantooms kunnen worden gemaakt om de nanodruppels te karakteriseren en de PFCnD’s akoestisch te moduleren na ODV om het contrast te verbeteren.

Introduction

Microbubbels zijn het meest alomtegenwoordige ultrasone contrastmiddel vanwege hun biocompatibiliteit en uitstekende echogeniciteit in vergelijking met zachte weefsels. Dit maakt ze waardevolle hulpmiddelen voor het visualiseren van de bloedstroom, orgaanafbakening en andere toepassingen¹. Hun grootte (1-10 μm), waardoor ze uitzonderlijk zijn voor beeldvorming op basis van hun resonantiefrequentie, beperkt hun toepassingen echter tot de vasculatuur².

Deze beperking heeft geleid tot de ontwikkeling van PFCnD’s, dat zijn nano-emulsies die bestaan uit een oppervlakteactieve stof die is omhuld rond een vloeibare perfluorkoolstofkern. Deze nanodeeltjes kunnen worden gesynthetiseerd in groottes zo klein als 200 nm en zijn ontworpen om te profiteren van “lekkende” vasculatuur of poriën en open fenestraties in tumorvasculatuur. Hoewel deze verstoringen tumorafhankelijk zijn, zorgt deze permeabiliteit voor extravasatie van nanodeeltjes van ~ 200 nm – 1,2 μm, afhankelijk van de tumor ^3,4. In hun oorspronkelijke vorm produceren deze deeltjes weinig tot geen ultrasoon contrast. Bij verdamping – akoestisch of optisch geïnduceerd – verandert de kernfase van vloeistof in gas, waardoor een tweeënhalf tot vijfvoudige toename van de diameter ^5,6,7 wordt geïnduceerd en fotoakoestisch en echoscopisch contrast wordt gegenereerd. Hoewel akoestische verdamping de meest voorkomende activeringsmethode is, creëert deze aanpak akoestische artefacten die de beeldvorming van de verdamping beperken. Bovendien vereisen de meeste perfluorkoolwaterstoffen gerichte echografie met een mechanische index boven de veiligheidsdrempel om te verdampen⁸. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van PFCnD’s met een lager kookpunt, die kunnen worden gesynthetiseerd door microbubbels te condenseren tot nanodruppels⁹. Deze druppels zijn echter vluchtiger en onderhevig aan spontane verdamping¹⁰.

Optische druppelverdamping (ODV) vereist daarentegen de toevoeging van een optische trigger zoals nanodeeltjes^11,12,13 of kleurstof ^6,14,15 en kan hogere kookpuntperfluorkoolwaterstoffen verdampen met behulp van fluences binnen de ANSI-veiligheidslimiet¹¹. PFCnD’s gesynthetiseerd met hogere kookpuntkernen zijn stabieler en zullen na verdamping opnieuw worden samengesteld, waardoor achtergrondvrije beeldvorming¹⁶, multiplexing¹⁷ en superresolutie^{18 mogelijk zijn}. Een van de belangrijkste beperkingen van deze technieken is het feit dat PFCnD’s met een hoog kookpunt echogeen zijn na verdamping gedurende slechts een kort tijdsbestek, op de schaal van milliseconden¹⁹, en relatief zwak zijn. Hoewel dit probleem kan worden verzacht door herhaalde verdampingen en gemiddelden, blijft detectie en scheiding van druppelsignaal een uitdaging.

Geïnspireerd door pulsinversie kunnen de duur en het contrast worden verbeterd door de fase van de ultrasone beeldvormingspuls^{te wijzigen 19}. Door de ultrasone beeldvormingspuls te starten met een zeldzaamheidsfase (n-puls), neemt zowel de duur als het contrast van de verdampte PFCnD’s toe. Daarentegen resulteert het starten van de ultrasone beeldvormingspuls met een compressiefase (p-puls) in een verminderd contrast en een kortere duur. Dit artikel zal beschrijven hoe optisch triggerbare perfluorkoolstof nanodruppels, polyacrylamidefantooms die vaak worden gebruikt bij beeldvorming kunnen worden gesynthetiseerd en contrastverbetering en verbeterde levensduur van het signaal kunnen worden aangetoond door akoestische modulatie.

Protocol

1. Perfluorkoolstof nanodruppel formulering Spoel een kolf met ronde bodem van 10 ml uit met chloroform en spoel een gasdichte glazen spuit van 10 μL en 1 ml met chloroform uit door herhaaldelijk het volledige spuitvolume aan te zuigen en in totaal drie keer te verdrijven.LET OP: Chloroform is vluchtig en kan giftig zijn bij inademing. Alle werkzaamheden met dit oplosmiddel moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. Voeg met behulp van de spuiten 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL 1,2-diste…

Representative Results

Succesvolle formulering en centrifugale scheiding van de PFCnD’s moeten druppels opleveren met een diameter van ongeveer 200-300 nm (figuur 1A). Onjuist gescheiden druppeltjes kunnen kleine pieken vertonen rond 1 μm. Deze oplossingen kunnen verder worden gesoniseerd om de grotere druppels te breken. De grootte van de druppels zal in de loop van de tijd toenemen als gevolg van coalescentie en/of diffusie in een proces dat bekend staat als Ostwald-rijping21,22</su…

Discussion

Sonde-sonicatie is een relatief eenvoudige en gemakkelijk te leren methode om PFCnD’s te fabriceren. Er zijn een paar stappen waar voorzichtigheid geboden is. Bij het hanteren van chloroform is het noodzakelijk dat een pipet met positieve verplaatsing of glazen spuiten wordt gebruikt, omdat deze vluchtig is en zal “lekken” uit standaard luchtverplaatsingspipetten. Bovendien, als u een positieve verplaatsing gebruikt, zorg er dan voor dat een geschikte tip wordt gebruikt, omdat chloroform de meeste plastic tips oplost, di…

Materials

Ammonium Persulfate (APS)	VWR	97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG)	Avanti Polar Lipids	880120C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur®	VWR	EM-1300	acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048	Sigma	405175	Infrared dye
L11-4v	Verasonics	–	ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8"	Qsonica LLC	4418	microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED)	VWR	97064-902	Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II	Ophir-Spiricon	7Z01550	laser power meter
Perfluorohexane	Fluoromed	APF-60M	perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	VWR	97062-732	Tablets used to make PBS
Q500	Qsonica LLC	Q500-110	Probe sonicator
Silica gel	Sigma-Aldrich	288500	2-25 μm particle size
Tempest 30	New wave research	–	Pulsed laser system
Vantage 128	Verasonics	–	research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments Ltd	–	Makes size measurements based on dynamic light scattering