Formulering og akustisk modulering af optisk fordampede perfluorcarbon nanodråber

Summary

Optisk aktiverede perfluorcarbon nanodråber viser løfte i billeddannelsesapplikationer uden for det vaskulære system. Denne artikel vil demonstrere, hvordan man syntetiserer disse partikler, tværbinding polyacrylamidfantomer og modulerer dråberne akustisk for at forbedre deres signal.

Abstract

Mikrobobler er det mest almindeligt anvendte billeddannelseskontrastmiddel i ultralyd. På grund af deres størrelse er de imidlertid begrænset til vaskulære rum. Disse mikrobobler kan kondenseres eller formuleres som perfluorcarbon nanodråber (PFCnD’er), der er små nok til at ekstravasere og derefter udløses akustisk på målstedet. Disse nanopartikler kan forbedres yderligere ved at inkludere en optisk absorber, såsom nær infrarødt organisk farvestof eller nanopartikler (f.eks. kobbersulfidnanopartikler eller guldnanopartikler / nanoroder). Optisk mærkede PFCnD’er kan fordampes gennem laserbestråling i en proces kendt som optisk dråbefordampning (ODV). Denne aktiveringsproces muliggør anvendelse af perfluorcarbonkerner med højt kogepunkt, som ikke kan fordampes akustisk under den maksimale mekaniske indekstærskel for diagnostisk billeddannelse. Kerner med højere kogepunkt resulterer i dråber, der vil rekondensere efter fordampning, hvilket resulterer i “blinkende” PFCnD’er, der kortvarigt producerer kontrast efter fordampning, før de kondenseres tilbage til nanodråbeform. Denne proces kan gentages for at producere kontrast efter behov, hvilket giver mulighed for baggrundsfri billeddannelse, multiplexing, superopløsning og kontrastforbedring gennem både optisk og akustisk modulering. Denne artikel vil demonstrere, hvordan man syntetiserer optisk triggerable, lipidskal PFCnD’er ved hjælp af sonde sonikering, skaber polyacrylamid fantomer til at karakterisere nanodråberne og akustisk modulere PFCnD’erne efter ODV for at forbedre kontrasten.

Introduction

Mikrobobler er det mest allestedsnærværende ultralydskontrastmiddel på grund af deres biokompatibilitet og fremragende ekkogenicitet sammenlignet med blødt væv. Dette gør dem til værdifulde værktøjer til visualisering af blodgennemstrømning, organafgrænsning og andre applikationer¹. Imidlertid begrænser deres størrelse (1-10 μm), hvilket gør dem usædvanlige til billeddannelse baseret på deres resonansfrekvens, deres anvendelser til vaskulaturen².

Denne begrænsning har ført til udviklingen af PFCnD’er, som er nanoemulsioner sammensat af et overfladeaktivt stof indkapslet omkring en flydende perfluorcarbonkerne. Disse nanopartikler kan syntetiseres i størrelser så små som 200 nm og er designet til at drage fordel af “utæt” vaskulatur eller porer og åbne fenestrationer, der findes i tumorvaskulatur. Mens disse forstyrrelser er tumorafhængige, giver denne permeabilitet mulighed for ekstravasation af nanopartikler fra ~ 200 nm – 1,2 μm afhængigt af tumoren ^3,4. I deres oprindelige form producerer disse partikler ringe eller ingen ultralydskontrast. Ved fordampning – induceret akustisk eller optisk – ændres kernefasen fra væske til gas, hvilket inducerer en to og en halv til fem gange stigning i diameter ^5,6,7 og genererer fotoakustisk og ultralydskontrast. Mens akustisk fordampning er den mest almindelige aktiveringsmetode, skaber denne tilgang akustiske artefakter, der begrænser billeddannelsen af fordampningen. Derudover kræver de fleste perfluorcarboner fokuseret ultralyd med et mekanisk indeks ud over sikkerhedstærsklen for at fordampe⁸. Dette har ført til udviklingen af PFCnD’er med lavere kogepunkt, som kan syntetiseres ved at kondensere mikrobobler til nanodråber⁹. Disse dråber er imidlertid mere flygtige og udsat for spontan fordampning¹⁰.

Optisk dråbefordampning (ODV) kræver på den anden side tilsætning af en optisk udløser såsom nanopartikler 11,12,13 eller farvestof 6,14,15 og kan fordampe perfluorcarboner med højere kogepunkt ved hjælp af fluencer inden for ANSI-sikkerhedsgrænsen ¹¹. PFCnD’er syntetiseret med kerner med højere kogepunkt er mere stabile og vil rekondensere efter fordampning, hvilket giver mulighed for baggrundsfri billeddannelse¹⁶, multiplexing 17 og superopløsning¹⁸. En af de største begrænsninger ved disse teknikker er det faktum, at PFCnD’er med højt kogepunkt er ekkogene efter fordampning i kun en kort tidsramme på skalaen millisekunder¹⁹ og er relativt svage. Selvom dette problem kan afhjælpes gennem gentagne fordampninger og gennemsnit, er detektion og adskillelse af dråbesignal fortsat en udfordring.

Med inspiration fra pulsinversion kan varigheden og kontrasten forbedres ved at ændre fasen af ultralydsbilledpulsen¹⁹. Ved at starte ultralydsbilledpulsen med en sjælden fraktionsfase (n-puls) øges både varigheden og kontrasten af de fordampede PFCnD’er. I modsætning hertil resulterer start af ultralydsbilledpulsen med en kompressionsfase (p-puls) i reduceret kontrast og kortere varighed. Denne artikel vil beskrive, hvordan man syntetiserer optisk triggerable perfluorcarbon nanodroplets, polyacrylamidfantomer, der almindeligvis anvendes i billeddannelse, og demonstrerer kontrastforbedring og forbedret signallevetid gennem akustisk modulering.

Protocol

1. Perfluorcarbon nanodråbe formulering Skyl en 10 ml rundbundet kolbe med chloroform ud, og vask en 10 μL og 1 ml gastæt glassprøjte med chloroform ved gentagne gange at opsuge hele sprøjtevolumen og udvise den i alt tre gange.FORSIGTIG: Chloroform er flygtig og kan være giftig ved indånding. Alt arbejde med dette opløsningsmiddel skal udføres i en røghætte. Ved hjælp af sprøjterne tilsættes 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC, 2…

Representative Results

Vellykket formulering og centrifugalseparation af PFCnD’erne bør give dråber omkring størrelsen 200-300 nm i diameter (figur 1A). Forkert adskilte dråber kan vise små toppe omkring 1 μm. Disse løsninger kan yderligere bade sonikeres for at bryde de større dråber op. Dråbernes størrelse vil stige over tid på grund af sammensmeltning og / eller diffusion i en proces kendt som Ostwald modning21,22 (figur…

Discussion

Sonde sonikering er en relativt enkel og let at lære metode til at fremstille PFCnD’er. Der er et par trin, hvor der skal udvises forsigtighed. Ved håndtering af chloroform er det bydende nødvendigt, at der anvendes en positiv forskydningspipette eller glassprøjter, da den er flygtig og vil “lække” fra standard luftforskydningspipetter. Hvis du bruger en positiv forskydning, skal du desuden sikre dig, at der anvendes en passende spids, da chloroform opløser de fleste plastspidser, hvilket kan indføre forurenende s…

Materials

Ammonium Persulfate (APS)	VWR	97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG)	Avanti Polar Lipids	880120C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur®	VWR	EM-1300	acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048	Sigma	405175	Infrared dye
L11-4v	Verasonics	–	ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8"	Qsonica LLC	4418	microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED)	VWR	97064-902	Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II	Ophir-Spiricon	7Z01550	laser power meter
Perfluorohexane	Fluoromed	APF-60M	perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	VWR	97062-732	Tablets used to make PBS
Q500	Qsonica LLC	Q500-110	Probe sonicator
Silica gel	Sigma-Aldrich	288500	2-25 μm particle size
Tempest 30	New wave research	–	Pulsed laser system
Vantage 128	Verasonics	–	research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments Ltd	–	Makes size measurements based on dynamic light scattering