Formulierung und akustische Modulation von optisch verdampften Perfluorcarbon-Nanotröpfchen

Summary

Optisch aktivierte Perfluorcarbon-Nanotröpfchen sind vielversprechend in bildgebenden Anwendungen außerhalb des Gefäßsystems. Dieser Artikel zeigt, wie diese Partikel synthetisiert, Polyacrylamidphantome vernetzt und die Tröpfchen akustisch moduliert werden, um ihr Signal zu verstärken.

Abstract

Mikrobläschen sind das am häufigsten verwendete bildgebende Kontrastmittel im Ultraschall. Aufgrund ihrer Größe sind sie jedoch auf Gefäßkompartimente beschränkt. Diese Mikrobläschen können kondensiert oder als Perfluorkohlenstoff-Nanotröpfchen (PFCnDs) formuliert werden, die klein genug sind, um zu extravasieren und dann akustisch an der Zielstelle ausgelöst zu werden. Diese Nanopartikel können durch die Aufnahme eines optischen Absorbers wie organischer Farbstoff im nahen Infrarot oder Nanopartikel (z. B. Kupfersulfid-Nanopartikel oder Goldnanopartikel / Nanostäbchen) weiter verbessert werden. Optisch markierte PFCnDs können durch Laserbestrahlung in einem Prozess verdampft werden, der als optische Tröpfchenverdampfung (ODV) bekannt ist. Dieser Aktivierungsprozess ermöglicht die Verwendung von Perfluorkohlenstoffkernen mit hohem Siedepunkt, die unter der maximalen mechanischen Indexschwelle für die diagnostische Bildgebung nicht akustisch verdampft werden können. Kerne mit höherem Siedepunkt führen zu Tröpfchen, die nach der Verdampfung wieder kondensieren, was zu “blinkenden” PFCnDs führt, die nach der Verdampfung kurz Kontrast erzeugen, bevor sie wieder in Nanotröpfchenform kondensieren. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um bei Bedarf Kontrast zu erzeugen, was eine hintergrundfreie Bildgebung, Multiplexing, Superauflösung und Kontrastverstärkung durch optische und akustische Modulation ermöglicht. Dieser Artikel zeigt, wie optisch triggerbare PFCnDs mit Lipidhülle unter Verwendung von Sondenbeschallung synthetisiert, Polyacrylamidphantome zur Charakterisierung der Nanotröpfchen erzeugt und die PFCnDs nach ODV akustisch moduliert werden, um den Kontrast zu verbessern.

Introduction

Mikrobläschen sind aufgrund ihrer Biokompatibilität und ausgezeichneten Echogenität im Vergleich zu Weichteilen das am weitesten verbreitete Ultraschallkontrastmittel. Dies macht sie zu wertvollen Werkzeugen zur Visualisierung des Blutflusses, der Organabgrenzung und anderer Anwendungen¹. Ihre Größe (1-10 μm), die sie aufgrund ihrer Resonanzfrequenz für die Bildgebung außergewöhnlich macht, beschränkt ihre Anwendungen jedoch auf das Gefäßsystem².

Diese Einschränkung hat zur Entwicklung von PFCnDs geführt, bei denen es sich um Nanoemulsionen handelt, die aus einem Tensid bestehen, das um einen flüssigen Perfluorkohlenstoffkern herum eingeschlossen ist. Diese Nanopartikel können in Größen von nur 200 nm synthetisiert werden und sind so konzipiert, dass sie “undichte” Gefäße oder Poren und offene Fensteröffnungen in Tumorgefäßen nutzen. Während diese Störungen tumorabhängig sind, ermöglicht diese Permeabilität eine Extravasation von Nanopartikeln von ~200 nm – 1,2 μm je nach Tumor ^3,4. In ihrer Ausgangsform erzeugen diese Partikel wenig bis gar keinen Ultraschallkontrast. Nach der Verdampfung – akustisch oder optisch induziert – wechselt die Kernphase von flüssig zu gasförmig, wodurch eine zweieinhalb- bis fünffache Vergrößerung des Durchmessers^{um 5,6,7} induziert wird und ein photoakustischer und Ultraschallkontrast erzeugt wird. Während die akustische Verdampfung die gebräuchlichste Aktivierungsmethode ist, erzeugt dieser Ansatz akustische Artefakte, die die Abbildung der Verdampfung einschränken. Darüber hinaus benötigen die meisten Perfluorkohlenwasserstoffe fokussierten Ultraschall mit einem mechanischen Index jenseits der Sicherheitsschwelle, um zu verdampfen⁸. Dies hat zur Entwicklung von PFCnDs mit niedrigerem Siedepunkt geführt, die durch Kondensieren von Mikrobläschen zu Nanotröpfchen synthetisiert werden können⁹. Diese Tröpfchen sind jedoch flüchtiger und unterliegen einer spontanen Verdampfung¹⁰.

Die optische Tröpfchenverdampfung (ODV) hingegen erfordert die Zugabe eines optischen Triggers wie Nanopartikel 11,12,13 oder Farbstoff 6,14,15 und kann Perfluorkohlenwasserstoffe mit höherem Siedepunkt unter Verwendung von Fluenzen innerhalb der ANSI-Sicherheitsgrenze ¹¹ verdampfen. PFCnDs, die mit Kernen mit höherem Siedepunkt synthetisiert werden, sind stabiler und kondensieren nach der Verdampfung wieder, was eine hintergrundfreie Bildgebung¹⁶, Multiplexing 17 und eine Superauflösung¹⁸ ermöglicht. Eine der Haupteinschränkungen dieser Techniken ist die Tatsache, dass PFCnDs mit hohem Siedepunkt nach der Verdampfung nur für einen kurzen Zeitraum auf der Skala von^{Millisekunden 19} echogen sind und relativ schwach sind. Während dieses Problem durch wiederholte Verdampfungen und Mittelwertbildung gemildert werden kann, bleibt die Erkennung und Trennung des Tröpfchensignals eine Herausforderung.

Inspiriert von der Pulsinversion können Dauer und Kontrast durch Modifizierung der Phase des Ultraschallbildpulses¹⁹ erhöht werden. Durch den Start des Ultraschall-Bildgebungspulses mit einer Verdünnungsphase (n-Puls) erhöht sich sowohl die Dauer als auch der Kontrast der verdampften PFCnDs. Im Gegensatz dazu führt das Starten des Ultraschallbildpulses mit einer Kompressionsphase (p-Puls) zu einem reduzierten Kontrast und einer kürzeren Dauer. Dieser Artikel beschreibt, wie optisch triggerbare Perfluorcarbon-Nanotröpfchen, Polyacrylamid-Phantome, die üblicherweise in der Bildgebung verwendet werden, synthetisiert werden können, und demonstriert Kontrastverstärkung und verbesserte Signallanglebigkeit durch akustische Modulation.

Protocol

1. Perfluorkohlenstoff-Nanotröpfchen-Formulierung Spülen Sie einen 10-ml-Rundkolben mit Chloroform aus und waschen Sie eine gasdichte 10-μL- und 1-ml-Glasspritze mit Chloroform aus, indem Sie das gesamte Spritzenvolumen wiederholt absaugen und insgesamt dreimal ausstoßen.ACHTUNG: Chloroform ist flüchtig und kann beim Einatmen giftig sein. Alle Arbeiten mit diesem Lösungsmittel sollten in einem Abzug durchgeführt werden. Mit den Spritzen werden 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL 1,2-D…

Representative Results

Eine erfolgreiche Formulierung und zentrifugale Trennung der PFCnDs sollte Tröpfchen mit einem Durchmesser von 200-300 nm ergeben (Abbildung 1A). Unsachgemäß getrennte Tröpfchen können kleine Peaks um 1 μm aufweisen. Diese Lösungen können weiter beschallt werden, um die größeren Tröpfchen aufzubrechen. Die Größe der Tröpfchen nimmt im Laufe der Zeit aufgrund von Koaleszenz und/oder Diffusion in einem Prozess zu, der als Ostwaldreifung bekannt ist21,22<su…

Discussion

Die Sondenbeschallung ist eine relativ einfache und leicht zu erlernende Methode zur Herstellung von PFCnDs. Es gibt ein paar Schritte, bei denen Vorsicht geboten ist. Beim Umgang mit Chloroform ist es unerlässlich, dass eine Verdrängerpipette oder Glasspritzen verwendet werden, da diese flüchtig ist und aus Standard-Luftverdrängerpipetten “ausläuft”. Wenn Sie eine positive Verschiebung verwenden, stellen Sie außerdem sicher, dass eine geeignete Spitze verwendet wird, da Chloroform die meisten Kunststoffspitzen auf…

Materials

Ammonium Persulfate (APS)	VWR	97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG)	Avanti Polar Lipids	880120C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur®	VWR	EM-1300	acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048	Sigma	405175	Infrared dye
L11-4v	Verasonics	–	ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8"	Qsonica LLC	4418	microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED)	VWR	97064-902	Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II	Ophir-Spiricon	7Z01550	laser power meter
Perfluorohexane	Fluoromed	APF-60M	perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	VWR	97062-732	Tablets used to make PBS
Q500	Qsonica LLC	Q500-110	Probe sonicator
Silica gel	Sigma-Aldrich	288500	2-25 μm particle size
Tempest 30	New wave research	–	Pulsed laser system
Vantage 128	Verasonics	–	research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments Ltd	–	Makes size measurements based on dynamic light scattering