Синтетический контроль антигена для иммуногистохимии
Summary
Эта работа документирует простой метод создания синтетических антигенов для иммуногистохимии. Методика адаптируется к различным антигенам в широком диапазоне концентраций. Образцы служат ориентиром для оценки эффективности и воспроизводимости внутри- и межанализа.
Abstract
Анализы иммуногистохимии (IHC) дают ценную информацию о паттернах экспрессии белка, надежная интерпретация которых требует хорошо охарактеризованных положительных и отрицательных контрольных образцов. Поскольку соответствующие элементы управления тканями или клеточными линиями не всегда доступны, простой метод создания синтетических элементов контроля IHC может быть полезным. Такой способ описан здесь. Он адаптируется к различным типам антигенов, включая белки, пептиды или олигонуклеотиды, в широком диапазоне концентраций. Этот протокол объясняет шаги, необходимые для создания синтетического контроля антигена, используя в качестве примера пептид из эритробластного онкогена человека B2 (ERBB2 / HER2) внутриклеточного домена (ICD), распознаваемого различными диагностически значимыми антителами. Серийные разведения пептида HER2 ICD в растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) смешивают с формальдегидом и нагревают в течение 10 мин при 85 °C для затвердевания и сшивки смеси пептид/BSA. Полученный гель может быть обработан, разделен и окрашен как ткань, что дает серию образцов известных концентраций антигенов, охватывающих широкий диапазон интенсивности окрашивания.
Этот простой протокол согласуется с обычными лабораторными процедурами гистологии. Метод требует только, чтобы у пользователя было достаточное количество желаемого антигена. Рекомбинантные белки, белковые домены или линейные пептиды, кодирующие соответствующие эпитопы, могут синтезироваться локально или коммерчески. Лаборатории, генерирующие собственные антитела, могут резервировать аликвоты иммунизирующего антигена в качестве синтетической контрольной мишени. Возможность создания четко определенных положительных элементов управления в широком диапазоне концентраций позволяет пользователям оценивать эффективность внутри- и межлабораторного анализа, получать представление о динамическом диапазоне и линейности своих анализов и оптимизировать условия анализа для своих конкретных экспериментальных целей.
Introduction
Иммуногистохимия (IHC) позволяет чувствительно и специфично, пространственно точно обнаруживать антигены-мишени в формалин-фиксированных, парафиновых (FFPE) участках тканей. Однако на результаты окрашивания IHC могут влиять несколько переменных, включая время теплой и холодной ишемии, фиксацию тканей, предварительную обработку тканей, реактивность и концентрацию антител, химию обнаружения анализа и время реакции1. Соответственно, воспроизводимые характеристики и интерпретация реакций МГК требуют строгого контроля этих переменных и использования хорошо охарактеризованных положительных и отрицательных контрольных образцов. Часто используемые контрольные элементы включают парафиновые внедренные ткани или культивируемые клеточные линии, известные из независимых анализов для экспрессии интересующего антигена, но такие образцы не всегда доступны1. Кроме того, уровни экспрессии целевых антигенов в тканях и контроле клеточных линий, как правило, понимаются только качественно и могут быть переменными. Контроль, содержащий воспроизводимые, точно известные концентрации целевого антигена, может помочь в оптимизации условий реакции IHC. Общий способ, адаптируемый к различным типам антигенов в физиологически значимом диапазоне концентраций для создания синтетических контрольных образцов IHC, был описан авторами2. Здесь представлен подробный протокол для создания и использования этого типа стандарта.
Соответствующие средства контроля необходимы для достоверной интерпретации анализов IHC 1,3,4. Ткани, культивируемые клетки и субстраты с пептидным покрытием использовались в качестве контроля IHC в соответствии с конкретными потребностями исследователей. Преимущества и ограничения, присущие использованию тканей в качестве средств контроля IHC, широко обсуждались 1,4. Для многих антител соответствующие элементы управления могут быть выбраны из выбранных нормальных тканей, содержащих клеточные популяции, экспрессирующие целевой антиген в широком динамическом диапазоне. Тканевые элементы контроля менее подходят, когда антиген-мишень недостаточно хорошо охарактеризован в отношении места экспрессии или изобилия, или когда потенциально перекрестно реагирующие антигены совместно экспрессируются в одних и тех же клетках или участках тканей. В этих контекстах блоки культивируемых клеточных линий, экспрессирующих интересующий антиген, могут быть полезны. Для предоставления дополнительных доказательств специфичности мишени клеточные линии могут быть спроектированы для чрезмерной или недостаточной экспрессии целевых антигенов. Например, такой подход недавно был использован для оценки различных анализов против PD-L1 с использованием тканевого микрочипа из изогенных клеточных линий, экспрессирующих диапазон антигена PD-L15. Практические ограничения на рутинное использование блоков клеточных линий включают стоимость и время, необходимые для получения достаточного количества клеток, а также тот факт, что экспрессия некоторых антигенов может быть ненадежно последовательной даже в пределах клональных клеточных линий6. Синтетические пептиды являются третьим вариантом контроля IHC для антител, которые распознают короткие линейные эпитопы. Стивен Боген и его коллеги опубликовали обширные публикации об использовании пептидов, соединенных с поверхностью стеклянных слайдов 7,8 и стеклянных бусин9. Одно исследование, проведенное этой группой, показало, что количественный анализ контроля IHC на основе пептидов может обнаружить вариации процесса окрашивания, пропущенные качественной оценкой контроля тканей, проанализированных параллельно10. В то время как стандарты, использующие антигены на основе бисера, могут быть широко применимы, многие детали являются собственностью авторов, ограничивая широкое распространение.
Другой подход к стандартам IHC включает целевые антигены в искусственно созданные белковые гели. Эта концепция была впервые продемонстрирована Пером Брандцаегом в 1972 году в исследовании, в котором нормальная сыворотка кролика была полимеризована с использованием глутаральдегида11. Небольшие блоки полученного геля затем замачивали в течение 1-4 недель в растворах, содержащих интересующие иммуноглобулиновые антигены в различных концентрациях. После фиксации спирта и встраивания парафина было показано, что участки полученного контроля окрашиваются с интенсивностью, соответствующей логарифму растворов антигенов, в которых они были пропитаны. Позже исследователи подготовили глутаральдегидные конъюгаты специфических аминокислот в разбавленных растворах BSA или гомогенатов мозга в качестве положительных контрольных элементов в исследованиях иммуноэлектронной микроскопии12,13. Более поздняя работа исследовала использование гелей, изготовленных из формальдегид-фиксированных белковых растворов, в качестве суррогатов для ткани FFPE в масс-спектрометрическом анализе14. Другая недавняя работа исследовала структуру и свойства гелей, образующихся при нагревании растворов сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота при различных концентрациях и рН15. Эти авторы обнаружили, что сывороточный альбумин образует три типа гелей, отличающихся механической эластичностью, сохранением вторичной структуры и способностью связывать жирные кислоты в зависимости от условий эксперимента. Вместе эти документы демонстрируют общую осуществимость применяемого здесь подхода. Белковые растворы определенного состава создают тканеподобные гели, которые могут быть дополнительно обработаны, разделены и окрашены с использованием обычных гистологических методов.
Этот протокол описывает образование синтетического контроля IHC, изготовленного из бычьего сывороточного альбумина (BSA), полимеризованного теплом и формальдегидом. Гели могут включать широкий спектр антигенов, включая полноразмерные белки, белковые домены и линейные пептиды, а также небелковые антигены, включая олигонуклеотиды2. В этой демонстрации используется пример антигена линейного пептида, кодирующего С-концевые 16 аминокислот человеческого белка ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (см. Таблицу материалов). Эта последовательность включает эпитопы, признанные тремя коммерчески доступными диагностически значимыми антителами, включая поликлональный реагент Herceptest (ENPEYLGLDVP) и моноклональные антитела CB11 (AENPEYL) и 4B5 (TAENPEYLGL) (см. Таблицу материалов)16.
Метод, продемонстрированный здесь, использует легкодоступные реагенты с использованием процессов и методов, знакомых любой практикующей гистологической лаборатории. Наиболее существенным ограничением является необходимость выявления и приобретения целевых антигенов, что во многих случаях может быть достигнуто при относительно скромных затратах. Поскольку эти синтетические элементы управления имеют полностью определенный состав и изготовлены простыми методами, они могут быть реализованы во многих лабораториях с воспроизводимыми результатами. Их использование может способствовать объективной, поддающейся количественной оценке результатов окрашивания IHC и обеспечивать большую внутри- и межлабораторную воспроизводимость.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод позволяет пользователю создавать однородные образцы известного состава и концентрации антигена в качестве стандартов в реакциях IHC, используя материалы и методы, знакомые большинству гистологических лабораторий. Наиболее важным шагом является идентификация эпитопа, с кот…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы с благодарностью отмечают своих коллег Джеффри Тома и Аймин Сонг за синтез пептидов, Нянфэн Гэ за построение TMA, Шари Лау за окрашивание IHC, Мелиссу Эдик за цифровое микроскопическое сканирование и Хай Нгу за количественную оценку цифрового изображения.
Materials
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
Riferimenti
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
- Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
- Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
- Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
- Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
- Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
- Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
- Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
- Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O’Leary, T. J., Mason, J. T. ‘Tissue surrogates’ as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
- Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
- Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
- Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
- Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
- Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
- Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).
