سهلة الاستخدام، عالية الإنتاجية، والآلية بالكامل برنامج الحصول على البيانات للجسيمات واحد Cryo-الإلكترون المجهر
Summary
يتطلب المجهر أحادي الجسيمات cryo-electron حزمة برامج مناسبة وخطوط أنابيب سهلة الاستخدام للحصول على البيانات التلقائية عالية الإنتاجية. هنا، نقدم تطبيق حزمة برامج اقتناء الصور المؤتمتة بالكامل، Latitude-S، وخط أنابيب عملي لجمع البيانات من الجزيئات الحيوية المهتزة في ظل ظروف جرعة منخفضة.
Abstract
في السنوات القليلة الماضية، مهدت التطورات التكنولوجية والمنهجية في المجهر أحادي الجسيمات للإلكترونات المبردة (cryo-EM) طريقا جديدا لتحديد البنية عالية الدقة للجزيئات الكبيرة البيولوجية. على الرغم من التقدم الملحوظ في cryo-EM ، لا يزال هناك مجال للتحسين في جوانب مختلفة من سير عمل تحليل الجسيمات الواحدة. يتطلب تحليل الجسيمات المفردة حزمة برامج مناسبة للحصول التلقائي على البيانات عالية الإنتاجية. تم تطوير العديد من حزم برامج الحصول التلقائي على البيانات للتصوير التلقائي للجسيمات المفردة cryo-EM في السنوات الثماني الماضية. تقدم هذه الورقة تطبيقا لخط أنابيب مؤتمت بالكامل للحصول على صورة للجزيئات الحيوية المهتزة في ظروف الجرعة المنخفضة.
وهو يوضح حزمة من البرامج ، والتي يمكن جمع البيانات cryo – EM تماما ، تلقائيا ، وعلى وجه التحديد. بالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم بسهولة المعلمات المجهرية المختلفة من قبل هذه الحزمة من البرامج. يوضح هذا البروتوكول إمكانات حزمة البرامج هذه في التصوير الآلي للبروتين عالي الارتفاع 2 (SARS-CoV-2) من متلازمة الالتهاب الرئوي الحاد الحاد (SARS-CoV-2) مع مجهر إلكتروني كريو 200 كيلو فولت مجهز بكاشف إلكترون مباشر (DED). تم الحصول على حوالي 3000 صورة فيلم cryo-EM في جلسة واحدة (48 ساعة) من جمع البيانات ، مما أسفر عن بنية تحليل ذري للبروتين المرتفع من السارس-CoV-2. وعلاوة على ذلك، تشير هذه الدراسة الهيكلية إلى أن البروتين ارتفاع يعتمد اثنين من الامتثالات الرئيسية، 1-RBD (مجال ملزم المستقبلات) مفتوحة وجميع RBD أسفل الامتثال مغلقة.
Introduction
أصبح cryo-EM أحادي الجسيمات تقنية بيولوجية هيكلية سائدة لتحديد البنية عالية الدقة للجزيئات الجزيئية البيولوجية1. تعتمد إعادة بناء الجسيمات المفردة على الحصول على عدد كبير من الصور الدقيقة للعينات المهتزة لاستخراج صور الجسيمات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) ، والتي تستخدم بعد ذلك لإعادة بناء بنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للجزيئات الجزيئية البيولوجية2،3. قبل تطوير DEDs، تراوحت الدقة التي تم تحقيقها من إعادة بناء جسيم واحد بين 4 و 30 Å4،5. في الآونة الأخيرة ، وصلت الدقة القابلة للتحقيق من cryo-EM أحادية الجسيمات إلى ما بعد 1.8 Å6. وكانت DED وبرامج الحصول الآلي على البيانات من المساهمين الرئيسيين في ثورة القرار هذه7 ، حيث التدخل البشري لجمع البيانات هو الحد الأدنى. عموما، يتم إجراء التصوير بالتبريد م بمعدلات جرعة الإلكترون منخفضة (20-100 e/Å2) لتقليل الأضرار الإشعاعية الناجمة عن شعاع الإلكترون من العينات البيولوجية، مما يساهم في انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) في الصورة. ويعوق هذا ال SNR المنخفض توصيف الهياكل عالية الاستبانة للجزيئات الجزيئية البيولوجية باستخدام تحليل جسيم واحد.
الجيل الجديد من أجهزة الكشف عن الإلكترونات هي أجهزة الكشف عن CMOS (التكميلية لأكسيد المعادن أشباه الموصلات) ، والتي يمكن التغلب على هذه العقبات المنخفضة المتعلقة SNR. تسمح كاميرات CMOS للكشف المباشر هذه بقراءة سريعة للإشارة ، والتي تساهم الكاميرا بسببها في وظيفة انتشار أفضل للنقاط ، وSNR مناسبة ، وكفاءة كمية ممتازة للمحققين (DQE) للجزيئات الكبيرة البيولوجية. توفر كاميرات الكشف المباشر SNR8 عالية وضوضاء منخفضة في الصور المسجلة ، مما يؤدي إلى زيادة كمية في كفاءة الكم المخبر (DQE) – وهو مقياس لمقدار الضوضاء التي يضيفها الكاشف إلى الصورة. هذه الكاميرات أيضا تسجيل الأفلام بسرعة مئات الإطارات في الثانية الواحدة، والتي تمكن من الحصول على البيانات بسرعة9،10. كل هذه الخصائص تجعل كاميرات الكشف المباشر السريع مناسبة لتطبيقات الجرعة المنخفضة.
تستخدم صور المكدس المصححة بالحركة لمعالجة البيانات لحساب التصنيف ثنائي الأبعاد وإعادة بناء خريطة كثافة ثلاثية الأبعاد للجزيئات الكبيرة باستخدام حزم برامج مختلفة مثل RELION11 وFREALIGN12 و cryoSPARC13 و cisTEM14 و EMAN215. ومع ذلك، بالنسبة لتحليل الجسيمات المفردة، هناك حاجة إلى مجموعة بيانات هائلة لتحقيق بنية عالية الدقة. ولذلك، فإن رسوم اكتساب البيانات التلقائية ضرورية للغاية لجمع البيانات. لتسجيل مجموعات بيانات cryo-EM كبيرة، تم استخدام العديد من حزم البرامج على مدى العقد الماضي. تم تطوير حزم برامج مخصصة، مثل AutoEM16 و AutoEMation17 و Leginon18 و SerialEM19 و UCSF-Image420 و TOM221 و SAM22 و JAMES23 و JADAS24 و EM-TOOLS و EPU، للحصول الآلي على البيانات.
تستخدم حزم البرامج هذه المهام الروتينية للعثور على مواقع الثقب تلقائيا من خلال ربط صور التكبير المنخفض بصور التكبير العالي ، مما يساعد في تحديد الثقوب ذات الجليد الزجاجي من سمك الجليد التكبيري للحصول على الصورة في ظل ظروف الجرعة المنخفضة. وقد خفضت هذه الحزم من البرامج عدد المهام المتكررة وزادت من الإنتاجية لجمع البيانات cryo-EM من خلال الحصول على كمية كبيرة من البيانات ذات نوعية جيدة لعدة أيام بشكل مستمر، دون أي انقطاع ووجود مادي للمشغل. Latitude-S هي حزمة برامج مماثلة، والتي تستخدم للحصول التلقائي على البيانات لتحليل الجسيمات المفردة. ومع ذلك ، فإن حزمة البرامج هذه مناسبة فقط لأجهزة الإزالة ال دي دي K2/K3 ويتم تزويدها بهذه الكاشفات.
يوضح هذا البروتوكول إمكانات Latitude-S في الحصول الآلي على صورة بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 مع كاشف إلكترون مباشر مجهز ب 200 كيلو فولت كريو-م (انظر جدول المواد). باستخدام هذه الأداة لجمع البيانات ، يتم الحصول تلقائيا على 3000 ملف فيلم من بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 ، ويتم إجراء المزيد من معالجة البيانات للحصول على بنية بروتين ارتفاع 3.9-4.4 Å.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S هي واجهة مستخدم بديهية ، والتي توفر بيئة لإعداد وجمع الآلاف من الصور الدقيقة عالية الدقة أو ملفات الأفلام تلقائيا في يومين. ويوفر سهولة الملاحة عبر الشبكات ويحافظ على موقف مرحلة المجهر في حين أنه ينتقل من التكبير المنخفض إلى التكبير عالية. كل خطوة من خطوات الحصول على البيانات مع Latitud…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بإدارة التكنولوجيا الحيوية، وإدارة العلوم والتكنولوجيا (DST) والعلوم، ووزارة تنمية الموارد البشرية (MHRD)، الهند، للتمويل ومرفق التبريد والتبريد في IISc-Bangalore. نعترف ببرنامج DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) وDST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) لمنشأة Cryo-EM الوطنية في IISc، بنغالور. نعترف بالدعم المالي المقدم من مجلس البحوث العلمية والهندسية (SERB) (المنحة رقم SB/S2/RJN-145/2015، SERB-EMR/2016/000608 وSrb-IPA/2020/000094)، DBT (المنحة رقم BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). نشكر السيدة إيشيكا برامانيك على إعداد شبكات التبريد و EM وجمع بيانات cryo-EM وإعداد جدول المواد. كما نشكر السيد سومان ميشرا على معالجة الصور بالتبريد ومساعدتنا في إعداد الأرقام. نشكر البروفيسور راغافان فاراداراجان لمساعدتنا في الحصول على عينة بروتين سبايك النقية لهذه الدراسة.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
Riferimenti
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy – TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
