Tek parçacıklı Cryo-elektron Mikroskopisi için Kullanıcı Dostu, Yüksek Verimli ve Tam Otomatik Veri Toplama Yazılımı
Summary
Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi ve kullanıcı dostu bir işlem hattı gerektirir. Burada, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküllerin veri toplanması için tam otomatik görüntü alma yazılım paketi, Latitude-S ve pratik bir boru hattı uygulamasını sunuyoruz.
Abstract
Son birkaç yılda, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopislerindeki (kriyo-EM) teknolojik ve metodolojik gelişmeler, biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için yeni bir yol açmıştır. Cryo-EM’deki dikkat çekici gelişmelere rağmen, tek parçacık analizi iş akışının çeşitli yönlerinde iyileştirme için hala bir kapsam vardır. Tek parçacıklı analiz, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi gerektirir. Son sekiz yılda tek parçacıklı kriyo-EM için otomatik görüntüleme için çeşitli otomatik veri toplama yazılım paketleri geliştirilmiştir. Bu makale, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküller için tam otomatik bir görüntü alma boru hattının bir uygulamasını sunun.
Cryo-EM verilerini tam, otomatik ve tam olarak toplayabilen bir yazılım paketi gösterir. Ek olarak, çeşitli mikroskobik parametreler bu yazılım paketi tarafından kolayca kontrol edilir. Bu protokol, bu yazılım paketinin doğrudan elektron dedektörü (DED) ile donatılmış 200 keV kriyo-elektron mikroskobu ile şiddetli akut solunum sendromu-koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) spike proteininin otomatik görüntülenmeslerindeki potansiyelini göstermektedir. Sars-CoV-2’nin spike proteininin atomik çözünürlüklü bir yapısını sağlayan tek bir oturumda (48 saat) yaklaşık 3.000 kriyo-EM film görüntüsü elde edildi. Ayrıca, bu yapısal çalışma, spike proteininin iki ana uygunluk benimsediğini göstermektedir, 1-RBD (reseptör bağlayıcı alan adı) açık ve tüm RBD kapalı konformasyonları.
Introduction
Tek parçacıklı kriyo-EM, biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için ana akım bir yapısal biyoloji tekniği haline gelmiştir1. Tek parçacıklı rekonstrüksiyon, daha sonra biyolojik bir makromolekülün üç boyutlu (3D) yapısını yeniden oluşturmak için kullanılan iki boyutlu (2B) parçacık görüntülerini çıkarmak için çok sayıda vitrifiye örnek mikrobu elde edilmesine bağlıdır2,3. DED’lerin geliştirilmesinden önce, tek parçacıklı rekonstrüksiyondan elde edilen çözünürlük 4 ila 30 Å4,5 arasında değişmektedir. Son zamanlarda, tek parçacıklı cryo-EM’den elde edilebilir çözünürlük 1.8 Å6’nın ötesine ulaştı. DED ve otomatik veri toplama yazılımı, veri toplama için insan müdahalesinin en az olduğu bu çözüm devrimine büyük katkıda bulundu7. Genellikle kriyo-EM görüntüleme, biyolojik örneklerin elektron ışın kaynaklı radyasyon hasarını en aza indirmek için düşük elektron doz oranlarında (20-100 e/Å2) gerçekleştirilir ve bu da görüntüdeki düşük sinyal-gürültü oranına (SNR) katkıda bulunur. Bu düşük SNR, tek parçacık analizi kullanılarak biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarının karakterizasyonuna engeldir.
Yeni nesil elektron dedektörleri, SNR ile ilgili bu düşük engelleri aşabilen CMOS (tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken) tabanlı dedektörlerdir. Bu doğrudan algılama CMOS kameralar, kameranın daha iyi nokta yayma işlevi, uygun SNR ve biyolojik makromoleküller için mükemmel dedektif kuantum verimliliği (DQE) katkıda bulunduğu için sinyalin hızlı okunmasına izin verir. Doğrudan algılama kameraları, kaydedilen görüntülerde yüksek SNR8 ve düşük gürültü sunar ve bu da dedektif kuantum verimliliğinde (DQE) nicel bir artışa neden olur ve bir dedektörün görüntüye ne kadar gürültü kattığının bir ölçüsü olur. Bu kameralar ayrıca saniyede yüzlerce kare hızında film kaydeder ve bu da hızlı veri alımını sağlar9,10. Tüm bu özellikler, hızlı doğrudan algılama kameralarını düşük doz uygulamaları için uygun hale getirir.
Hareket düzeltilmiş yığın görüntüleri, RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 ve EMAN215 gibi çeşitli yazılım paketlerini kullanarak makromoleküllerin 2B sınıflandırmasını hesaplamak ve 3B yoğunluk haritasını yeniden oluşturmak için veri işleme için kullanılır. Ancak, tek parçacık analizi için, yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek için muazzam bir veri kümesi gereklidir. Bu nedenle, otomatik veri toplama geçiş ücretleri veri toplama için son derece önemlidir. Büyük kriyo-EM veri kümelerini kaydetmek için son on yılda birkaç yazılım paketi kullanılmıştır. Otomatik Veri Toplama için AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ve EPU gibi özel yazılım paketleri geliştirilmiştir.
Bu yazılım paketleri, düşük büyütme görüntülerini yüksek büyütme görüntüleriyle ilişkilendirerek delik konumlarını otomatik olarak bulmak için rutin görevleri kullanır, bu da düşük doz koşullarında görüntü alımı için uygun buz kalınlığının vitreus buz ile deliklerin tanımlanmasına yardımcı olan. Bu yazılım paketleri, tekrarlayan görevlerin sayısını azalttı ve herhangi bir kesintiye uğramadan ve operatörün fiziksel varlığı olmadan birkaç gün boyunca sürekli olarak çok miktarda kaliteli veri elde ederek kriyo-EM veri toplamanın verimini artırdı. Latitude-S, tek parçacık analizi için otomatik veri toplama için kullanılan benzer bir yazılım paketidir. Ancak, bu yazılım paketi yalnızca K2/K3 DED’ler için uygundur ve bu dedektörlerle sağlanır.
Bu protokol, SARS-CoV-2 spike proteininin 200 keV kriyo-EM ile donatılmış doğrudan elektron dedektörü ile otomatik görüntü alımında Latitude-S’in potansiyelini göstermektedir ( bkz. Malzeme Tablosu). Bu veri toplama aracı kullanılarak, SARS-CoV-2 spike proteininin 3.000 film dosyası otomatik olarak elde edilir ve 3.9-4.4 şçözünürlüklü başak protein yapısı elde etmek için daha fazla veri işleme gerçekleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S, iki gün içinde binlerce yüksek çözünürlüklü mikrografiyi veya film dosyasını otomatik olarak kurmak ve toplamak için bir ortam sağlayan sezgisel bir kullanıcı arayüzüdür. Izgaralarda kolay gezinme sağlar ve düşük büyütmeden yüksek büyütmeye geçerken mikroskop aşamasının konumunu korur. Latitude-S ile veri toplamanın her adımı, basit bir kullanıcı arayüzü, 4,5 GB/s hıza kadar hızlı veri akışı ve edinme sırasında verilerin aynı anda görüntülenmesi gibi özellikl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biyoteknoloji, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (DST) ve Bilim Bakanlığı ile İnsan Kaynakları Geliştirme Bakanlığı (MHRD), Hindistan’ı, IISc-Bangalore’daki kriyo-EM tesisini finanse etmek için kabul ediyoruz. IISc, Bangalore’daki National Cryo-EM tesisi için DBT-BUILDER Programı (BT/INF/22/SP22844/2017) ve DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) onaylıyoruz. Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 ve SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Kriyo-EM ızgaraları, kriyo-EM veri toplama ve Malzeme Masası’nı hazırladığı için Bayan Ishika Pramanick’e teşekkür ederiz. Ayrıca Bay Suman Mishra’ya kriyo-EM görüntü işleme ve rakamları hazırlamamıza yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma için saflaştırılmış spike protein örneğini elde etmemize yardımcı olduğu için Prof. Raghavan Varadarajan’a teşekkür ederiz.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
Riferimenti
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy – TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
