Summary
We beschrijven een dissectietechniek die de architectuur van de neuromusculaire overgang behoudt en een gedetailleerde immunocytochemische studie van motorneuronen in het volwassen Drosophila-been mogelijk maakt.
Abstract
Drosophila melanogaster vertegenwoordigt een genetisch handelbaar model om neuronale structuur en functie te bestuderen, en daaropvolgende veranderingen in ziektetoestanden. De goed gekarakteriseerde larvale neuromusculaire overgang wordt vaak gebruikt voor dergelijke studies. Snelle larvale ontwikkeling gevolgd door spierhitolyse en remodellering van het zenuwstelsel tijdens metamorfose maakt dit model echter problematisch voor de studie van langzame leeftijdsafhankelijke degeneratieve veranderingen zoals die optreden bij amyotrofische laterale sclerose. Als alternatief leven volwassen vliegen 90 dagen en kan het volwassen been worden gebruikt om motorneuronveranderingen in de loop van de volwassen levensduur te bestuderen met behulp van in vivo fluorescerende beeldvorming door de cuticula. Hier beschrijven we een beendissectietechniek in combinatie met immunocytochemie, die de studie van moleculaire veranderingen op de neuromusculaire kruising van geïdentificeerde volwassen beenmotorneuronen mogelijk maakt. Deze technieken kunnen worden gekoppeld aan een groot aantal antilichamen die zowel pre- als post-synaptische structuren labelen. Samen maken deze procedures een completere karakterisering van langzame leeftijdsafhankelijke veranderingen bij volwassen vliegen mogelijk en kunnen ze worden toegepast op meerdere motorneuronziektemodellen.
Introduction
Motorneuron (MN) ziekten omvatten een groep heterogene aandoeningen die progressieve degeneratie omvatten die leidt tot spierafbraak en verlamming als een primair klinisch fenotype1. Hoewel zeldzaam met een wereldwijde prevalentie van 4,5 per 100.000, wordt verwacht dat deze prevalentie zal toenemen met een vergrijzende bevolking2. Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is de meest voorkomende MN-ziekte (MND) en is meestal fataal binnen een korte tijd na diagnose zonder dat er bestaande ziektemodificerende behandelingen beschikbaar zijn3. MND's delen een langdurige presymptomatische fase met vroege moleculaire biomarkerveranderingen en functionele beeldvormingsveranderingen bij patiënten4. Vroege presymptomatische cellulaire pathologie wordt ook waargenomen in niet-menselijke ziektemodellen5,6,7,8. De studie van vroege veranderingen op de neuromusculaire kruising is belangrijk voor het begrijpen van de pathogenese van MN-ziekte en kan helpen bij het ontwikkelen van vroege diagnostiek en potentiële therapieën.
Een schat aan genetische en moleculaire hulpmiddelen bestaat in Drosophila om de structuur en functie van de neuromusculaire junctie te ontleden (NMJ, zie9 voor een overzicht van de goed gekarakteriseerde larvale NMJ). Deze hulpmiddelen in combinatie met een korte levensduur maken Drosophila een uitstekend model om neurodegeneratieve veranderingen bij de NMJ te bestuderen. In het bijzonder zijn MNs die volwassen spieren innerveren aanwezig gedurende de ~ 90-daagse volwassen levensduur en zijn ze onderhevig aan normale verouderingsprocessen10,11,12,13. De volwassen MN's bieden daarom de mogelijkheid om langzame degeneratieve veranderingen te bestuderen in tegenstelling tot larvale NMJ's die slechts gedurende een korte periode van ~ 1 week voorafgaand aan de metamorfose bestaan14,15.
Hier beschrijven we een dissectieprocedure waarmee we immunocytochemische analyse van MN's in het volwassen been kunnen uitvoeren. Elk volwassen been wordt geïnnerveerd door ~ 50 MNs, die synapsen op de bijbehorende beenspier om de voortbeweging te stimuleren. De beenanatomie, mechanische fysiologie en neurobiologie is goed beschreven16,17,18. Axon-prieeltjes van been-MNs zijn eerder gekenmerkt door beeldvorming door cuticula in met rug gevulde of genetisch gelabelde celpopulaties met behulp van het bipartiete Gal4 / UAS-systeem en beeldvormingsmethoden zijn eerder gepubliceerd19. De hier gepresenteerde dissectiemethoden behouden de axonvertakkingsmorfologie en stellen ons in staat om een breed scala aan antilichamen te gebruiken om verschillende moleculaire componenten van de NMJ te labelen. Ons eerdere werk heeft zich gericht op projecties van een gedefinieerd MN in het metathoracale (3e) been, dat de tibia levatorspier (tilm) innerveert en consistente arborisatiepatronen en boutongetallen vertoont. Aanvankelijk bestudeerden we leeftijdsafhankelijke veranderingen in Drosophila superoxide dismutase 1 (dsod1) mutanten en vonden veranderingen die consistent waren met de ontmanteling van de NMJ20. Deze dissectiemethoden bieden de mogelijkheid om langzame degeneratieve veranderingen bij de NMJ beter te karakteriseren voor andere ALS-modellen, basisstudies van veroudering en andere MN-geassocieerde ziekten.
Figuur 1. Werkstroomoverzicht voor het ontleden van benen. Zie protocol voor gedetailleerde stappen. (A,B) Vliegen worden geselecteerd en verdoofd. (C) Vliegen worden overgebracht op methanol en gewassen met PBS. (D) De metathoracale benen worden verwijderd aan de basis van de coxa terwijl ze worden gevisualiseerd met een ontleedmicroscoop (~ 30x vergroting); schaalbalk = 500 μm. (E) De poten worden vervolgens gedurende 30 minuten in 3,7% formaldehyde/PBS (FA) oplossing gefixeerd in putten van 24-putplaten en vervolgens wordt FA verwijderd door wasbeurten met PBS. (F, G, H) Benen worden overgebracht naar siliconen elastomeer ontleedbakken en een stuk cuticula wordt verwijderd van het proximale dijbeen met behulp van afgeschuinde tang terwijl gevisualiseerd onder een ontleedmicroscoop op 80x; schaalbalk = 50 μm. (I) Poten worden na dissectie gefixeerd in FA en gewassen in PBS en vervolgens PBT (PBS+ 0,1% niet-ionische oppervlakteactieve stof). (J) Benen worden onderworpen aan immunocytochemische kleuring. (K,L) Poten worden overgebracht naar een glazen dia, gewist in montagemedia en bedekt met een dekplaat met kleiafstandhouders; schaalstaven = 2 mm en 500 μm. (M) Benen worden in beeld gebracht door confocale microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
De procedures voor het opstellen van werkoplossingen die in combinatie met dit protocol worden gebruikt, worden beschreven in tabel 1.
| Reagens | Voorbereiding | Opslag | |||
| PBS | Maak een werkvoorraad van 1x PBS uit een 10x PBS-stamoplossing door te verdunnen in gedestilleerd water. De pH van de werkende PBS-voorraad moet 7,2- 7,4 zijn | 4 °C gedurende 1+ maanden totdat bacteriële besmetting zichtbaar is. | |||
| PBT | 1x PBS-oplossing met 0,1% niet-ionische oppervlakteactieve stof. | 4 °C gedurende 1+ maanden totdat bacteriële besmetting zichtbaar is. | |||
| FA | 3,7% formaldehyde-oplossing gemaakt van een 37% formaldehyde-voorraad en verdund in 1x PBS. | Kamertemperatuur. Maak elke dag van de dissectie vers | |||
| LET OP: Formaldehyde geleverd als 37% stockoplossing is een potentieel carcinogeen en moet worden verdund in een zuurkast. | |||||
| 5% aardgas | 5% normaal geitenserum verdund in PBT. Het gebruikte serum moet overeenkomen met de soort van het secundaire antilichaam dat moet worden gebruikt. | 4 °C gedurende enkele weken totdat bacteriële besmetting zichtbaar is | |||
Tabel 1. Oplossingen voor het uitvoeren van immunocytochemie van het volwassen Drosophila-been .
1. Initiële fixatie van weefsels
- Selecteer ongeveer 10 vliegen voor elk genotype en elke leeftijd. Verdoving op een vliegenkussen onder koolstofdioxide (figuur 1A, B).
OPMERKING: Begin met meer vliegen dan nodig is om te zorgen voor een voldoende grote steekproefgrootte na dissectie. - Breng met een kwast vliegen over op koude methanol in een glazen put of schaal gedurende ongeveer 30 seconden tot 1 minuut (figuur 1C). De methanol lost de cuticulaire koolwaterstoffen op en vliegen kunnen nu worden ondergedompeld in plaats van te drijven in waterige oplossingen.
- Breng met een tang voorzichtig vliegen over naar PBS. Spoel 3x in ijskoude PBS om overtollige methanol te verwijderen en houd vliegen in PBS op ijs tot dissectie en fixatie. Ontleed op dit punt vliegen en fixeer binnen de kortst mogelijke tijd (<30 minuten).
- Om de benen te isoleren, breng je vliegen over naar een siliconen elastomeerdissectieschotel gevuld met koude PBS, verwijder je de metathoracale poten bij de coxa met twee paar # 5 Dumont-tang of knip je de poten met een Vanna-schaar (figuur 1D). Breng de poten over naar een put in een plastic 24 putplaat gevuld met 1 ml PBS en houd de plaat op ijs totdat alle poten zijn verwijderd en overgebracht naar putten.
OPMERKING: Elke put kan minstens 20 poten bevatten. - Vervang de PBS-oplossing door 1 ml FA-oplossing en draai gedurende 30 minuten op een nutator (figuur 1E). De instelling van de nutator moet op een gemiddelde snelheid (17 rpm) worden ingesteld. Zorg ervoor dat de poten gedurende deze tijd volledig ondergedompeld zijn in FA-oplossing voor voldoende fixatie.
- Om de FA-oplossing te verwijderen, wast u 3x snel 1 ml PBS, gevolgd door nog eens 3 wasbeurten gedurende 5 minuten elk in 1 ml PBS. Houd weefsels in 1 ml PBS op ijs voorafgaand aan en tijdens de hieronder beschreven dissectiestappen.
2. Het verwijderen van de beenschubben en antilichaamkleuring
- De nagelriem verwijderen
- De ontleedtang is cruciaal voor succes. Introduceer lichte parallelle bochten in beide tanden aan het einde van # 5 superfijne tang om een schuine kant te bieden waarmee de cuticula oppervlakkig kan worden vastgepakt in plaats van te worden geprikt, wat het weefsel kan ruïneren (figuur 1F, G).
OPMERKING: Parallel gebogen tanden moeten in gesloten toestand nog steeds contact met elkaar maken over de gehele lengte van de pen (figuur 2). - Breng de poten over naar een siliconen elastomeerschaal in PBS voor dissectie. Oriënteer een been zodat de voorste zijde naar boven is gericht (zie figuur 3 voor de anatomie en oriëntatie van het been). Houd met één tang het tibia-segment tegen de siliconen elastomeerschaal. Gebruik de andere tang die met de schuine kant naar beneden wordt gehouden, pak een stuk nagelriem aan het distale uiteinde van het dijbeen en trek in de proximale richting naar de trochanter.
- Blijf methodisch de nagelriem verwijderen totdat de naakte spier zichtbaar is in het proximale uiteinde van het dijbeen (figuur 1F, G, H).
OPMERKING: Maak alleen oppervlakkig contact met de benen met behulp van de afgeschuinde kant van de tang om te voorkomen dat de spieren worden getrokken. - Zodra alle poten zijn ontleed, vervangt u PBS door FA om de poten gedurende 30 minuten te bevestigen met schudden op een moerator op gemiddelde snelheid (figuur 1I). Was monsters in 1 ml PBS gedurende 3 keer snel en vervolgens 3 keer gedurende 5 minuten elk in PBT (figuur 1J).
OPMERKING: Als kleuring met monoklonaal antilichaam NC82 (anti-bruchpilot) om actieve zones te labelen, post-fix dan gedurende 20 minuten omdat dit antigeen gevoelig is voor langere fixaties.
- De ontleedtang is cruciaal voor succes. Introduceer lichte parallelle bochten in beide tanden aan het einde van # 5 superfijne tang om een schuine kant te bieden waarmee de cuticula oppervlakkig kan worden vastgepakt in plaats van te worden geprikt, wat het weefsel kan ruïneren (figuur 1F, G).
Figuur 2. Aangepaste tang gebruikt voor het ontleden van volwassen benen. (A) De uiteinden van de tang worden gebogen en vervolgens aan de onderkant afgeplat (pijl) waardoor een schuine kant ontstaat door op een slijpsteen te vijlen. (B) De tanden van ongewijzigde tangen zijn daarentegen niet gebogen. Schaalbalk = 1 mm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Antilichaamkleuring
- Om weefsels te blokkeren voor antilichaamkleuring, vervangt u 1 ml PBT door blokkerende oplossing bestaande uit 1 ml 5% NGS verdund in PBT. Incubeer ontlede poten gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C terwijl u schommelt op een moerator bij gemiddelde snelheid (17 tpm). Bedek tijdens alle incubaties putten met afdichtingstape naast de plastic afdekking (figuur 1J).
OPMERKING: 24 putplaten worden gebruikt voor immunocytochemie in plaats van 1,5 ml of 2 ml microcentrifuge omdat eerdere pogingen om microcentrifugebuizen te gebruiken resulteerden in gebroken benen en beschadigd weefsel. - Verwijder de blokkerende oplossing en voeg 300 ml primaire antilichamen toe die zijn verdund in een verse blokkerende oplossing. Het kleine volume antilichaam dat wordt gebruikt, moet voldoende zijn om de weefsels te bedekken. Sluit putten opnieuw af met laboratoriumafdichtingstape en plastic deksel en incubeer een nacht bij 4 °C met schudden op een moeraar op gemiddelde snelheid (figuur 1J). De informatie over het werkende antilichaamreagens en de concentraties die voor deze onderzoeken zijn gebruikt, zijn beschreven in tabel 2.
- Was primaire antilichamen in 1 ml PBT gedurende 3 keer kort en vervolgens 3 keer gedurende 15 minuten elk (figuur 1J).
OPMERKING: Verdunde primaire antilichamen kunnen worden opgeslagen en hergebruikt als ze gedurende maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard. - Blokkeer weefsels opnieuw in 1 ml van 5% NGS gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 C (figuur 1J).
- Verwijder de 5% NGS-blokkerende oplossing en voeg 300 μL van de juiste verdunde fluorescerende geconjugeerde secundaire antilichamen toe. Voeg bovendien 1:2000 verdunning van fluorescentie-geconjugeerde falloïdine toe om spieren te labelen (figuur 1J).
- Voor secundaire antilichaamincubaties sluit u putten af met laboratoriumafdichtingstape en deksel. Wikkelplaten ook in aluminiumfolie om fluoroforen tegen licht te beschermen. Incubeer gedurende 6-8 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
- Was secundaire antilichamen en falloïdine zoals beschreven in stap 2.2.3 hierboven. Afdekplaten met aluminiumfolie tussen de wasbeurten om fluoroforen tegen licht te beschermen.
- Om weefsels te blokkeren voor antilichaamkleuring, vervangt u 1 ml PBT door blokkerende oplossing bestaande uit 1 ml 5% NGS verdund in PBT. Incubeer ontlede poten gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C terwijl u schommelt op een moerator bij gemiddelde snelheid (17 tpm). Bedek tijdens alle incubaties putten met afdichtingstape naast de plastic afdekking (figuur 1J).
3. Montagepoten
- Breng de benen over naar een glijbaan met behulp van een tang en oriënteer de voorste kant naar boven. Bedek de poten met bevestigingsmedia (figuur 1K, L).
OPMERKING: De ontlede poten kunnen worden aangezogen met een P1000 pipetpunt als de bodemboring wordt verbreed door te snijden met een scheermesje. - Voeg kleiafstandhouders toe aan een afdekplaat van 22x22 mm2 (# 1,5 dikte) door de afdekplaathoeken over een klein bolletje modelleerklei te schrapen. Elke hoek moet een kleine hoeveelheid klei hebben van 1-2 mm dik (figuur 1K).
- Om de dia te bedekken, voegt u de coverslip toe met de kleiafstandhouders naar de glijbaan gericht en duwt u voorzichtig op de hoeken totdat de coverslip net het oppervlak van het dijbeen raakt.
- Om verdamping te voorkomen, sluit u de randen van de deklip af met nagellak en laat u drogen op een donkere plaats (ongeveer 10 minuten) voordat u deze bij 4 °C bewaart totdat u ze afbeeldt.
4. Beeldvorming
- Afbeelding met een confocale microscoop (figuur 1M). Neem een doorgelaten lichtkanaal op om de kwaliteit van de dissectie beter te beoordelen en monsters met zichtbaar verstoorde spiervezels in het interessegebied moeten worden weggegooid.
- Begin met het afbeelden van z-stacks met 20x vergroting met 2x zoom en een totale beelddiepte van ~ 40 mm die overeenkomt met de dikte van het dijbeen. Voor fluorescerende signaaldetectie kunt u beelden vastleggen met resoluties die consistent zijn met Nyquist-bemonstering (we gebruiken 1024 x 1024 pixels met een verblijfsinstelling van 8-10 μs / pixel). De signaalintensiteit moet zich in het lineaire bereik bevinden dat wordt bereikt door de instellingen voor hoogspanningsversterking aan te passen. Zodra de versterkingsinstellingen zijn ingesteld voor een reeks monsters binnen een experiment, mogen ze niet worden gewijzigd zodat signaalintensiteiten tussen monsters kunnen worden vergeleken.
- Voor het afbeelden van synaptische boutons en andere subcellulaire structuren, leg confocale beelden vast met ≥ 60x vergroting. De detectorinstellingen moeten zich in het lineaire bereik bevinden, terwijl de pixeldichtheid, verblijfsinstellingen en z-diepte vergelijkbaar moeten zijn voor afbeeldingen die zijn vastgelegd met een lagere vergroting (stap 4.1).
Representative Results
Figuur 4 toont een representatief voorbeeld van een metathoracaal been gekleurd met anti-hrp, anti-dlg en falloïdine. Voor dissecties die de nagelriem uit het proximale deel van het dijbeen verwijderen, zullen stereotiepe priëlen zichtbaar zijn in de buurt van de pees die gemakkelijk wordt gedetecteerd door autofluorescentie. Merk op dat antilichaampenetratie in het been plaatsvindt over een korte afstand buiten het gebied waarin de cuticula is verwijderd (figuur 4A). Deze gebieden kunnen effectief in beeld worden gebracht wanneer een sterk fluorescentiesignaal aanwezig is. Beeldvorming bij lage vergroting (20x met een 2x zoom) maakt het mogelijk om eenvoudig te bepalen hoeveel cuticula wordt verwijderd en 2) of er schade is opgetreden tijdens dissectie. Verhoogde vergroting (60x) toont stereotiepe projecties op de tilm (figuur 4B). Ons werk heeft zich gericht op één MN, waarschijnlijk afgeleid van de I-MN-afstamming die de tilm in het proximale dijbeen innerveert (doos, figuur 4B en figuur 4C). Het verder vergroten van de vergroting (100x met 2x zoom) zorgt voor een effectieve visualisatie van synaptische boutons (Figuur 4D).
Om morfologische veranderingen bij de volwassen NMJ in de loop van de tijd te bestuderen, hebben we eerder dsod1-mutanten gebruikt als een model van ALS. Bouton-zwelling treedt op bij oude dsod1H71Y-mutanten ten opzichte van dsod1null en dsod1+ (figuur 5A, B). Bij de larvale NMJ wordt vaak monoklonaal antilichaam NC82 gebruikt om actieve zones te labelen en dit kunnen deze structuren gemakkelijk worden gevisualiseerd bij de volwassen NMJ (figuur 5C). Zwak-positieve HRP axon takken zijn overvloedig aanwezig in dsod1H71Y mutanten en deze takken vertonen vaak zwakke en diffuse BRP lokalisatie (pijlen).
Belangrijk voor neurodegeneratie, commercieel verkrijgbare antilichamen kunnen ubiquitinated eiwitten detecteren die vaak worden aangetroffen in aggregaten, en we hebben ubiquitinated aggregaten gedetecteerd in terminale axonen van MNs in verouderde gemuteerde dsod1-vliegen en in spieren (figuur 6A). Ook antilichamen die mitochondriën labelen, kunnen ook morfologische veranderingen met de leeftijd detecteren (figuur 6B).
Voor sommige preparaten maakt spierbeschadiging tijdens de dissectie het monster onbruikbaar. In het begin kan dergelijke schade een veel voorkomende gebeurtenis zijn, maar verbetering treedt op met de praktijk. Voorbeelden van goede dissecties zijn figuur 7A, C, terwijl slechte dissecties worden weergegeven in figuur 7B, D. Slechte dissecties veroorzaken desorganisatie van spiervezels zoals gedetecteerd door fasecontrastmicroscopie (figuur 7B) of ontbrekende spiervezels gevisualiseerd door fluorescerend geconjugeerd falloïdine (figuur 7D, pijl). De combinatie van het gebruik van falloïdine om spieren te labelen en doorgegeven lichtbeelden kan helpen om dergelijke spierschade te detecteren die mogelijk niet duidelijk is bij het bekijken onder een ontleedmicroscoop.
Figuur 3. Anatomie van het Drosophila-been . (A) Diagram van de voorste zijde van een metathoracaal been, gekenmerkt door de aanwezigheid van borstelharen in tegenstelling tot de prominente naakte cuticula die aan de achterste zijde aanwezig is. Het gesegmenteerde been bestaat uit de coxa (Cx), trochanter (Tr), femur (Fe), tibia (Ti), 5 tarsale segmenten (Ta1-5) en klauw (Cl) in volgorde van proximaal (Pr) tot distaal (Di). Dorsale (D) en ventrale (V) zijden van het dijbeen zijn ook geïndiceerd. Schaalbalk = 100 μm. (B) Diagram van het dijbeen met de tibia levator (tilm), tibia depressor (tidm), lange peesspier 2 (ltm2) en tibia reductor (tirm) spieren en axon projecties in het proximale femur die de tilm innerveren. Deze stereotiepe axonale projecties worden verondersteld te zijn afgeleid van I-lineage neuroblasten16, en de tweede arborisatie is het gemakkelijkst toegankelijk door dissectie (boxed). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Ontleed metathoracaal femur onthulde stereotiepe MN-architectuur die de tilm innerverde. Immunocytochemie werd gebruikt om neuronen (HRP), schijven-groot (DLG) en spieren (falloïdine) te markeren. Z-stacks werden vastgelegd door confocale microscopie beeldvorming door het hele dijbeen en getoond als een maximale serieprojectie. (A) Een doorgelaten lichtkanaal werd ook opgenomen om te illustreren dat er geen detecteerbare spierschade optrad tijdens de dissectie. Beeld werd vastgelegd bij 20x vergroting, schaalbalk = 50 μm. (B) Geïdentificeerde prieeltjes geassocieerd met de tilm (boxed area, center), scale bar = 20 μm; en (C) bij 60x vergroting, schaalbalk = 20 μm. (D) DLG rond boutons was zichtbaar bij wilde dieren wanneer ze werden afgebeeld bij 100x vergroting met 2x zoom; schaalbalk = 2 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Voorbeeld van leeftijdsafhankelijke veranderingen in boutonmorfologie die kunnen worden gedetecteerd met behulp van de beendissectietechniek. Bouton zwelling wordt gezien bij oude dsod1H71Y mutanten. (A) Representatieve beelden van HRP-gekleurde boutons van jonge (nieuw gesloten, dag 0 volwassenen) en oude (dag 10) vliegen, schaalbalk = 1 μm. (B) Bouton-maten werden gekwantificeerd uit respectievelijke genotypen met behulp van de meetfunctie binnen ImageJ. p<0,0001 (2-weg ANOVA met post-hoc Tukey test). (C) Actieve zones in synaptische boutons gelabeld met monoklonaal antilichaam NC82 (anti-bruchpilot); schaalbalk = 1 μm. Figuur gewijzigd van20Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Gemeenschappelijke markers geassocieerd met neurodegeneratieve ziekte gebruikt in Drosophila beenpreparaten. (A) Subcellulaire polyubiquitinated aggregaten worden gedetecteerd in terminale axonen en spieren van verouderde dsod1H71Y-vliegen. Immunocytochemie met behulp van anti-polyubiquitine (FK2) detecteert puncta (pijlen) in verouderde dsod1H71Y/H71Y, schaalbalk = 20 μm (links) en 5 μm (rechts). (B) Gezwollen mitochondriën kunnen worden gedetecteerd met behulp van anti-ATP5A, schaalbalk = 1 μm. Figuur gewijzigd van20Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Voorbeelden van goede en slechte dissecties. (A) Dissectie die de onderliggende spierarchitectuur niet verstoorde. (B) Een voorbeeld van een slechte dissectie die gerafelde spiervezels (pijl) vertoonde en niet voor analyse kon worden gebruikt. Beide monsters werden in beeld gebracht door middel van fasecontrastmicroscopie. Schaalbalk = 50 μm. (C) Voorbeeld van een goede dissectie afgebeeld door confocale microscopie met HRP (groen) en falloïdine (blauw). (D) Een slechte dissectie waarbij dorsale spiervezels van de TILM ontbreken (pijl). Schaalbalk = 50 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antilichaam/Kleuring | Verdunning* |
| Anti-ATP5A | 1:500 |
| Anti-bruchpilot (nc82) | 1:20 |
| Anti-cysteïne string eiwit (ab49) | 1:50 |
| Anti-schijven groot (4F3) | 1:200 |
| Anti-HRP | 1:550 |
| Anti-polyubiquitine (FK2) | 1:1000 |
| Anti-repo (8D12) | 1:5 |
| Geit anti-muis secundair antilichaam | 1:800 |
| Falloidine | 1:2000 |
| *Verdunnen in 5% NGS |
Tabel 2. Antilichamen en verdunningen. De commerciële leveranciers van de antilichamen die in deze onderzoeken worden gebruikt, zijn opgenomen in de materialenlijst.
Discussion
Het Drosophila volwassen been is een ideaal model om neurodegeneratie te bestuderen gezien de relatieve eenvoud met goed gekarakteriseerde MN's in kaart gebracht uit neuroblastlijnen en stereotiepe arborisatiepatronen. Verschillende rapporten hebben eerder been-MN's gebruikt voor de studie van neurodegeneratieve ziekten21,22. Deze studies maakten gebruik van GFP-expresserende lijnen in combinatie met mozaïekanalyse met een repressible cell marker (MARCM) om door de cuticula te beeldlen en documenteerden een reeks morfologische veranderingen. Beeldvorming van volwassen NMJ's door immunocytochemie met gereseceerde cuticula maakt verdere karakterisering mogelijk met de mogelijkheid om complexe moleculaire veranderingen te volgen met behulp van een toolbox van beschikbare antilichamen.
Het immunocytochemische gedeelte van dit protocol is relatief standaard en kan onafhankelijk van het genotype worden geïmplementeerd (zie23 voor een uitstekende beschrijving van algemene antilichaamkleuringsmethoden voor gebruik met Drosophila). Bovendien kunnen parameters zoals fluorescentie-intensiteit, axontaklengte en boutonaantallen en -grootte worden bepaald met behulp van een verscheidenheid aan beschikbare ImageJ-macro's zodra afbeeldingen zijn vastgelegd en gedetailleerde methoden voor kwantitatieve analyse zijn gepubliceerd (zie bijvoorbeeld 24,25,26). De dissectietechniek is dus de belangrijkste innovatie die hier wordt beschreven. Voorafgaand aan dissectie worden vliegen ondergedompeld in een alcohol om cuticulaire koolwaterstoffen te strippen. Zowel ethanol als methanol worden vaak voor dit doel gebruikt; we hebben echter alleen methanol gebruikt. Cruciaal voor het succes van de dissectie zijn verschillende factoren: ten eerste zorgt het gebruik van een aangepaste tang met een schuine kant voor zeer oppervlakkig contact met de cuticula. Ten tweede, met behulp van een ontleedmicroscoop die in staat is tot 60-100x totale vergroting, zodat het oppervlak van de cuticula duidelijk zichtbaar is. Voor microscopen met een lagere maximale vergroting zijn 2x objectieven beschikbaar voor de meest voorkomende merken en zouden voldoende moeten zijn in combinatie met bestaande lenzen. Ten derde maakt de eerste fixatiestap de nagelriem broos en gemakkelijker weg te trekken zonder de spieren eronder te beschadigen. Overfixatie bij deze stap maakt het hele been te stijf voor een effectieve dissectie. Daarom moet de initiële fixatie worden beperkt tot 30 minuten. Het formaldehydefixatiemiddel zal gedurende deze korte periode niet voldoende doordringen om het onderliggende weefsel effectief te kruisen en daarom is een tweede fixatiestap noodzakelijk. Voorafgaand aan de tweede fixatie moeten weefsels op ijs worden gehouden om afbraak en veranderingen in morfologie te voorkomen. Ten vierde hebben we ontdekt dat het ontleden van monsters terwijl kou ook belangrijk is, waarschijnlijk om vergelijkbare redenen omdat de nagelriem broos is en een klein stukje gemakkelijker kan worden verwijderd.
Met oefening vinden we dat ~ 50% van de dissecties bruikbaar zal zijn binnen geen waarneembare weefselschade. Hoewel dit percentage laag lijkt in vergelijking met sommige andere weefsels, is de dissectieprocedure snel en kunnen veel benen in 30- 60 minuten worden verwerkt. Daarom, zelfs als de slagingspercentages in eerste instantie laag zijn, is het haalbaar om 4-5 goede monsters te verkrijgen voor elke experimentele groep. Een beperking kan echter het aantal vliegen zijn dat op een bepaald moment beschikbaar is als genotypen en /of leeftijd resulteren in aanzienlijke letaliteit.
Een andere beperking is dat we andere delen van het been buiten het proximale gebied van het dijbeen niet hebben kunnen ontleden vanwege de grootte. Zo kunnen we geïdentificeerde MN-prieeltjes bestuderen die de TILM betrouwbaar innerveren en is het mogelijk om de cuticula boven de tibia-depressorspier te ontleden met kleine veranderingen in de manier waarop het been is georiënteerd bij het ontleden. De toegang tot andere delen van het been is echter moeilijker gebleken zonder de axonale architectuur tijdens de dissectie te verstoren.
Hier presenteren we dissectiemethoden om veranderingen bij de volwassen NMJ te detecteren voor gedefinieerde MN's die de tilm innerveren met behulp van immunocytochemie. Het been is nuttig als een eenvoudig systeem, geïnnerveerd door slechts ~ 50 MNs en bevat 14 spieren met een goed beschreven anatomie. Het ontleedde beenpreparaat kan worden gebruikt voor alle genotypen en een reeks antilichamen is beschikbaar voor NMJ-visualisatie zonder de noodzaak om genotypisch complexe voorraden reportergenconstructen in mutante achtergronden te bouwen. Deze aanpak zal een meer gedetailleerde karakterisering van veranderingen bij de NMJ voor MN-ziekten en andere leeftijdsgerelateerde aandoeningen mogelijk maken.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Wij danken Eric Roberts voor haar advies over beeldvorming. We willen ook Information Technology Services aan het Rhode Island College bedanken en in het bijzonder Michael Caine en Jake Douglas voor videografie. Monoklonale antilichamen anti-dlg en anti-brp werden ontwikkeld door respectievelijk UC-Berkeley en Universitaetsklinikim Wuerzburg, en werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, gecreëerd door de NICHD van de NIH en onderhouden aan de Universiteit van Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242, VS. Het hier gerapporteerde onderzoek werd volledig ondersteund door het Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer [P20GM103430].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
References
- McDermott, C. J., Shaw, P. J. Diagnosis and management of motor neurone disease. BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).
- Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).
- Foster, L. A., Salajegheh, M. K. Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).
- Bede, P., Pradat, P. F. Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease. Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).
- Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).
- Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. Elife. 7, (2018).
- Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
- Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).
- Harris, K. P., Littleton, J. T. Transmission, Development, and Plasticity of Synapses. Genetics. 201 (2), 345-375 (2015).
- Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging. Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).
- Banerjee, S., et al. Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing. Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).
- Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).
- Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H.
- Truman, J. W. Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila. Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Enriquez, J., et al. Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).
- Agudelo, A., et al. Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS. Biology Open. 9 (10), (2020).
- Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).
- Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2. Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry. Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).
- Castells-Nobau, A., et al. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).
- Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).
