Fremstilling af multifunktionelle silkebaserede mikrokapsler fyldt med DNA-plasmider, der koder for RNA-aptamerere og ribotekser
Summary
Protokollen beskriver dannelsen af robuste og biokompatible DNA-belastede mikrokapsler som multipleksede di vitro-biosensorer, der er i stand til at spore flere ligander.
Abstract
Vi introducerer en protokol til fremstilling af DNA-belastede silkefibroinmikrokapsler via lag-for-lag (LbL) samlingsmetoden på offersfæriske kerner. Efter adsorption af et primlag og DNA-plasmider blev dannelsen af robuste mikrokapsler lettet ved at inducere β-ark i silke sekundær struktur under akut dehydrering af et enkelt silkelag. Derfor forekom lagdelingen via flere hydrogenbindinger og hydrofobe interaktioner. Ved adsorption af flerlagede skaller kan kerneskalstrukturerne yderligere funktionaliseres med guldnanopartikler (AuNP’er) og / eller antistoffer (IgG), der skal bruges til teledetektion og / eller målrettet levering. Justering af flere nøgleparametre under sekventiel aflejring af nøglemakromolekyler på silicakerner, såsom tilstedeværelsen af en polymerprimer, koncentrationen af DNA og silkeprotein samt et antal adsorberede lag, resulterede i biokompatible, DNA-ladede mikrokapsler med variabel permeabilitet og DNA-belastninger. Efter opløsning af silicakerner demonstrerede protokollen dannelsen af hule og robuste mikrokapsler med DNA-plasmider immobiliseret til den indre overflade af kapselmembranen. Oprettelse af en selektivt permeabel biokompatibel membran mellem DNA-plasmiderne og det ydre miljø bevarede DNA’et under langtidsopbevaring og spillede en vigtig rolle i det forbedrede outputrespons fra rumligt begrænsede plasmider. DNA-skabelonernes aktivitet og tilgængelighed blev testet under di vitro-transkriptions- og translationsreaktioner (cellefrie systemer). DNA-plasmider, der koder for RNA-lyspatamerer og ribotekster, blev med succes aktiveret med tilsvarende analysander, som det blev visualiseret under lokalisering af fluorescerende mærkede RNA-transkripter eller GFPa1-protein i skalmembranerne.
Introduction
Området syntetisk biologi giver unikke muligheder for at udvikle sensorevner ved at udnytte naturlige mekanismer udviklet af mikroorganismer til at overvåge deres miljø og potentielle trusler. Det er vigtigt, at disse sensormekanismer typisk er forbundet med en reaktion, der beskytter disse mikroorganismer mod skadelig eksponering, regulerer genekspression for at afbøde negative virkninger eller forhindre indtagelse af giftige materialer. Der har været en betydelig indsats for at konstruere disse mikroorganismer til at skabe helcellesensorer, der udnytter disse naturlige reaktioner, men omdirigerer dem til at genkende nye mål og / eller producere et målbart signal, der kan måles til kvantificeringsformål (typisk fluorescens)1,2. På nuværende tidspunkt tyder bekymringer med hensyn til anvendelsen af genetisk modificerede mikroorganismer (GMO’er), navnlig ved udsætning i miljøet eller menneskekroppen på grund af lækage af hele celler eller noget af deres genetiske materiale, selv om de er indkapslet i en polymermatrix, på, at der er behov for alternative måder at udnytte disse sensormetoderpå 3.
En effektiv tilgang til at udnytte fordelene ved mikroorganismer-baseret sensing uden bekymring for udbredelsen af GMO’er er brugen af in vitro transkriptions-/oversættelsessystemer (IVTT). Fra et praktisk perspektiv består IVTT-systemer af en blanding, der indeholder de fleste af cellekomponenterne i en aktiv tilstand, der er blevet “ekstraheret” fra celler på forskellige måder, herunder sonikering, perleslag eller andre4. Det endelige produkt af denne proces er en biokemisk reaktionsblanding, der allerede er optimeret til at udføre transkription og oversættelse, der kan bruges til at teste forskellige sensorer i et “åbent beholder” -format uden de begrænsninger, der er forbundet med brugen af hele celler (membrandiffusion, transformationseffektivitet, celletoksicitet osv.). Det er vigtigt, at forskellige sensorkomponenter kan tilføjes kvantitativt, og deres effekt studeres ved forskellige optiske og spektrometriske teknikker, som vi har demonstreret5. Det er blevet bemærket, at IVTT-systemernes ydeevne kan være inkonsekvent; Nylige undersøgelser har imidlertid vist tilgange til at standardisere deres forberedelse og karakterisering, hvilket er til stor hjælp, når man studerer deres ydeevne i sensordesign6. For nylig er der demonstreret mange eksempler på IVTT-systemer, der bruges til at skabe papirbaserede assays gennem frysetørring af deres komponenter i papirmatricer, herunder påvisning af tungmetalioner, lægemidler, quorum-sensingelementer og andre 7,8,9. Et spændende anvendelsesområde for IVTT-baserede sensorer er deres anvendelse i sensorapplikationer i forskellige typer miljøer, herunder jord, vand og menneskekroppen. For at implementere disse IVTT-systemer i disse udfordrende miljøer skal der implementeres en indkapslingstilgang for at indeholde IVTT-komponenterne og beskytte dem mod nedbrydning.
De mest almindelige indkapslingsmetoder til IVTT-systemer inkluderer brugen af lipidkapsler, miceller, polymersomer og andre tæt lukkede mikrobeholdere10,11,12. En ulempe ved denne fremgangsmåde er behovet for at inkorporere enten passive eller aktive mekanismer til transport af materialer ind og ud af containerne for at muliggøre kommunikation med det ydre miljø og give sensorfunktioner. For at overvinde nogle af disse problemer rapporterer undersøgelsen her en metode, der giver en enkel, men effektiv tilgang til at indkapsle kodningsmaterialerne til forskellige sensordesign, der skal udtrykkes i IVTT-systemer. Denne tilgang er baseret på brugen af lag-for-lag (LbL) aflejring af en biopolymer i nærvær af plasmider af interesse for at skabe hule mikrokapsler med høj porøsitet, hvilket gør det muligt for det beskyttede genetiske materiale at interagere med de forskellige komponenter i IVTT efter eget valg. Undersøgelsen viste, at indkapslede plasmider kunne dirigere transkription og translation, når de aktiveres inden for denne polymere matrix, som vist med responsen fra en plasmidkodet aptamer og en riboswitch til deres tilsvarende mål. Derudover beskytter denne LbL-belægning plasmiderne i flere måneder uden særlige opbevaringsforhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektivt permeable hydrogelmikrokapsler fyldt med forskellige typer DNA-kodede sensordesign kan fremstilles efter denne protokol. Et af de karakteristiske træk ved LbL-tilgangen er evnen til at skræddersy kompleksiteten af mikrokapsler under bottom-up-samlingen, som normalt starter med adsorption af molekylære arter på offerskabeloner. Ved omhyggeligt at justere koncentrationerne af de oprindelige komponenter, pH-betingelser og antallet af lag kan mikrokapsler med forskellige DNA-belastningsparametre, funktionalitet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af LRIR 16RH3003J-bevilling fra Air Force Office of Scientific Research samt Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S &T Priorities (ARAP) -programmet fra US Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering.
Plasmidvektorsekvensen for ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) blev generøst leveret af Dr. J. Gallivan. Silkeormskopuder fra Bombyx mori blev generøst doneret af Dr. D.L. Kaplan fra Tufts University, MA.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
Riferimenti
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B., Reischl, U. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
