يصف البروتوكول تكوين كبسولات دقيقة قوية ومتوافقة حيويا محملة بالحمض النووي على أنها أجهزة استشعار حيوية متعددة الإرسال في المختبر قادرة على تتبع العديد من الروابط.
نقدم بروتوكولا لإعداد كبسولات فيبروين الحريرية المحملة بالحمض النووي عبر طريقة التجميع طبقة تلو الأخرى (LbL) على النوى الكروية القربانية. بعد امتصاص الطبقة الأولية وبلازميدات الحمض النووي ، تم تسهيل تكوين كبسولات دقيقة قوية عن طريق تحفيز صفائح β في بنية ثانوية من الحرير أثناء الجفاف الحاد لطبقة حرير واحدة. ومن ثم ، حدثت الطبقات عن طريق روابط هيدروجينية متعددة وتفاعلات كارهة للماء. عند امتزاز الأصداف متعددة الطبقات ، يمكن زيادة تشغيل هياكل القشرة الأساسية باستخدام جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) و / أو الأجسام المضادة (IgG) لاستخدامها في الاستشعار عن بعد و / أو التسليم المستهدف. أدى ضبط العديد من المعلمات الرئيسية أثناء الترسيب المتسلسل للجزيئات الرئيسية على نوى السيليكا مثل وجود برايمر بوليمر ، وتركيز الحمض النووي وبروتين الحرير ، بالإضافة إلى عدد من الطبقات الممتصة إلى كبسولات دقيقة متوافقة حيويا ومحملة بالحمض النووي مع نفاذية متغيرة وتحميل الحمض النووي. عند انحلال نوى السيليكا ، أظهر البروتوكول تكوين كبسولات دقيقة مجوفة وقوية مع بلازميدات الحمض النووي يجمد على السطح الداخلي لغشاء الكبسولة. أدى إنشاء غشاء متوافق حيويا قابل للنفاذ بشكل انتقائي بين بلازميدات الحمض النووي والبيئة الخارجية إلى الحفاظ على الحمض النووي أثناء التخزين طويل الأجل ولعب دورا مهما في تحسين استجابة الإخراج من البلازميدات المحصورة مكانيا. تم اختبار نشاط قوالب الحمض النووي وإمكانية الوصول إليها أثناء تفاعلات النسخ والترجمة في المختبر (الأنظمة الخالية من الخلايا). تم تنشيط بلازميدات الحمض النووي التي تشفر أبتامير إضاءة الحمض النووي الريبي ومفاتيح الريبوسويتشات بنجاح مع التحليلات المقابلة ، كما تم تصوره أثناء توطين نسخ الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت أو بروتين GFPa1 في أغشية القشرة.
يوفر مجال البيولوجيا التركيبية فرصا فريدة لتطوير قدرات الاستشعار من خلال استغلال الآليات الطبيعية التي تطورها الكائنات الحية الدقيقة لرصد بيئتها والتهديدات المحتملة. الأهم من ذلك ، ترتبط آليات الاستشعار هذه عادة باستجابة تحمي هذه الكائنات الحية الدقيقة من التعرض الضار ، وتنظم التعبير الجيني للتخفيف من الآثار السلبية أو منع تناول المواد السامة. كانت هناك جهود كبيرة لهندسة هذه الكائنات الحية الدقيقة لإنشاء أجهزة استشعار خلية كاملة تستفيد من هذه الاستجابات الطبيعية ولكن إعادة توجيهها للتعرف على أهداف جديدة و / أو لإنتاج إشارة قابلة للقياس يمكن قياسها لأغراض القياس الكمي (عادة مضان)1,2. في الوقت الحالي ، تشير المخاوف المتعلقة باستخدام الكائنات الحية الدقيقة المعدلة وراثيا (GMOs) ، خاصة عند إطلاقها في البيئة أو جسم الإنسان ، بسبب تسرب خلايا كاملة أو بعض موادها الوراثية ، حتى لو كانت مغلفة في مصفوفة بوليمر ، إلى أن هناك حاجة إلى طرق بديلة لاستغلال أساليب الاستشعار هذه3.
نهج قوي لاستغلال فوائد الاستشعار القائم على الكائنات الحية الدقيقة دون القلق بشأن نشر الكائنات المعدلة وراثيا هو استخدام أنظمة النسخ / الترجمة في المختبر (IVTT). من منظور عملي ، تتكون أنظمة IVTT من خليط يحتوي على معظم مكونات الخلية في حالة نشطة تم “استخراجها” من الخلايا بوسائل مختلفة ، بما في ذلك صوتنة ، ضرب حبة ، أو غيرها4. المنتج النهائي لهذه العملية هو خليط تفاعل كيميائي حيوي تم تحسينه بالفعل لإجراء النسخ والترجمة التي يمكن استخدامها لاختبار أجهزة استشعار مختلفة بتنسيق “وعاء مفتوح” ، دون القيود المرتبطة باستخدام خلايا كاملة (انتشار الغشاء ، كفاءة التحويل ، سمية الخلية ، إلخ). الأهم من ذلك ، يمكن إضافة مكونات استشعار مختلفة كميا ، ودراسة تأثيرها بواسطة تقنيات بصرية ومطيفية مختلفة ، كما أوضحنا5. وقد لوحظ أن أداء أنظمة IVTT يمكن أن يكون غير متسق. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة مناهج لتوحيد إعدادها وتوصيفها ، وهو أمر مفيد للغاية عند دراسة أدائها في تصميم أجهزة الاستشعار6. في الآونة الأخيرة ، تم عرض العديد من الأمثلة على أنظمة IVTT المستخدمة لإنشاء مقايسات ورقية من خلال التجفيد لمكوناتها في مصفوفات الورق ، بما في ذلك الكشف عن أيونات المعادن الثقيلة والأدوية وعناصر استشعار النصاب وغيرها7،8،9. مساحة تطبيق مثيرة لأجهزة الاستشعار المستندة إلى IVTT هي استخدامها في تطبيقات الاستشعار في أنواع مختلفة من البيئات ، بما في ذلك التربة والمياه وجسم الإنسان. من أجل نشر أنظمة IVTT هذه في هذه البيئات الصعبة ، يجب تنفيذ نهج تغليف لاحتواء مكونات IVTT وحمايتها من التدهور.
تشمل طرق التغليف الأكثر شيوعا لأنظمة IVTT استخدام كبسولات الدهون والمذيلات والبوليميرات وغيرها من الحاويات الدقيقة المغلقةبإحكام 10،11،12. ويتمثل أحد عيوب هذا النهج في الحاجة إلى إدماج آليات سلبية أو إيجابية لنقل المواد داخل الحاويات وخارجها للسماح بالاتصال بالبيئة الخارجية وتوفير قدرات الاستشعار. للتغلب على بعض هذه المشكلات ، تشير الدراسة هنا إلى طريقة توفر نهجا بسيطا ولكنه فعال لتغليف مواد التشفير لتصميمات أجهزة الاستشعار المختلفة التي سيتم التعبير عنها في أنظمة IVTT. يعتمد هذا النهج على استخدام ترسب طبقة تلو الأخرى (LbL) للبوليمر الحيوي في وجود البلازميدات ذات الأهمية لإنشاء كبسولات دقيقة مجوفة ذات مسامية عالية ، مما يسمح للمادة الوراثية المحمية بالتفاعل مع المكونات المختلفة ل IVTT المختار. أظهرت الدراسة أن البلازميدات المغلفة يمكن أن توجه النسخ والترجمة عند تنشيطها داخل هذه المصفوفة البوليمرية ، كما هو موضح مع استجابة الأبتامير المشفر بالبلازميد والريبوسويتش إلى أهدافهما المقابلة. بالإضافة إلى ذلك ، يحمي طلاء LbL هذا البلازميدات لعدة أشهر دون أي ظروف تخزين خاصة.
يمكن تحضير كبسولات هيدروجيل دقيقة قابلة للنفاذ بشكل انتقائي محملة بأنواع مختلفة من تصميمات أجهزة الاستشعار المشفرة بالحمض النووي باتباع هذا البروتوكول. تتمثل إحدى السمات المميزة لنهج LbL في القدرة على تكييف تعقيد الكبسولات الدقيقة أثناء التجميع من أسفل إلى أعلى ، والذي يبدأ عادة بامتصاص …
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال منحة LRIR 16RH3003J من مكتب البحث العلمي التابع للقوات الجوية ، بالإضافة إلى برنامج البيولوجيا التركيبية للبحوث التطبيقية للبيئات العسكرية للنهوض بأولويات العلوم والتكنولوجيا (ARAP) التابع لمكتب وكيل وزارة الدفاع الأمريكي للبحوث والهندسة.
تم توفير تسلسل ناقل البلازميد ل ThyRS (pSALv-RS-GFPa1 ، 3.4 كيلو بايت) بسخاء من قبل الدكتور ج. جاليفان. تم التبرع بشرانق دودة القز من Bombyx mori بسخاء من قبل الدكتور D.L. كابلان من جامعة تافتس ، ماساتشوستس.
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |