RNA Aptamerleri ve Riboswitch'leri kodlayan DNA Plazmidleri ile Yüklü Çok Fonksiyonlu İpek Bazlı Mikrokapsüllerin Hazırlanması
Summary
Protokol, sağlam ve biyouyumlu DNA yüklü mikrokapsüllerin oluşumunu, birkaç ligandı izleyebilen çoklanmış in vitro biyosensörler olarak tanımlar.
Abstract
DNA yüklü ipek fibroin mikrokapsüllerinin, kurban küresel çekirdekler üzerinde Katman Katman (LbL) montaj yöntemiyle hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Bir asal tabakanın ve DNA plazmidlerinin adsorpsiyonunu takiben, tek bir ipek tabakasının akut dehidrasyonu sırasında ipek sekonder yapıda β-tabakaların indüklenmesiyle sağlam mikrokapsüllerin oluşumu kolaylaştırılmıştır. Bu nedenle, katmanlama çoklu hidrojen bağı ve hidrofobik etkileşimler yoluyla gerçekleşti. Çok katmanlı kabukların adsorpsiyonu üzerine, çekirdek-kabuk yapıları, uzaktan algılama ve / veya hedeflenen teslimat için kullanılacak altın nanopartiküller (AuNP’ler) ve / veya antikorlar (IgG) ile daha da işlevselleştirilebilir. Bir polimer astarının varlığı, DNA ve ipek proteininin konsantrasyonu ve bir dizi adsorbe edilmiş katmanın yanı sıra bir dizi adsorbe edilmiş katman gibi anahtar makromoleküllerin silika çekirdekleri üzerinde sıralı birikimi sırasında birkaç anahtar parametrenin ayarlanması, değişken geçirgenlik ve DNA yüklemelerine sahip biyouyumlu, DNA yüklü mikrokapsüllerle sonuçlandı. Silika çekirdeklerinin çözünmesi üzerine, protokol, kapsül zarının iç yüzeyine hareketsiz hale getirilmiş DNA plazmidleri ile içi boş ve sağlam mikrokapsüllerin oluşumunu gösterdi. DNA plazmidleri ve dış ortam arasında seçici olarak geçirgen biyouyumlu bir zar oluşturmak, uzun süreli depolama sırasında DNA’yı korudu ve mekansal olarak sınırlandırılmış plazmidlerden gelen gelişmiş çıktı tepkisinde önemli bir rol oynadı. DNA şablonlarının aktivitesi ve erişilebilirliği, in vitro transkripsiyon ve translasyon reaksiyonları (hücresiz sistemler) sırasında test edildi. RNA ışıklandırma aptamerlerini ve riboswitchlerini kodlayan DNA plazmidleri, floresan olarak etiketlenmiş RNA transkriptlerinin veya GFPa1 proteininin kabuk zarlarında lokalizasyonu sırasında görselleştirildiği gibi, karşılık gelen analitlerle başarıyla aktive edildi.
Introduction
Sentetik biyoloji alanı, çevrelerini ve potansiyel tehditlerini izlemek için mikroorganizmalar tarafından geliştirilen doğal mekanizmalardan yararlanarak algılama yeteneklerini geliştirmek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. Önemli olarak, bu algılama mekanizmaları tipik olarak bu mikroorganizmaları zararlı maruziyetten koruyan, olumsuz etkileri hafifletmek veya toksik maddelerin alımını önlemek için gen ekspresyonunu düzenleyen bir yanıtla bağlantılıdır. Bu mikroorganizmaları, bu doğal tepkilerden yararlanarak tüm hücre sensörleri oluşturmak üzere tasarlamak, ancak yeni hedefleri tanımak ve / veya nicelleştirme amacıyla (tipik olarak floresan) ölçülebilen ölçülebilir bir sinyal üretmek için yeniden yönlendirmek için önemli çabalar sarf edilmiştir1,2. Şu anda, genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların (GDO’lar) kullanımıyla ilgili endişeler, özellikle çevrede veya insan vücudunda salınırken, tüm hücrelerin veya genetik materyallerinin bir kısmının sızması nedeniyle, bir polimer matrisinde kapsüllenmiş olsa bile, bu algılama yaklaşımlarından yararlanmak için alternatif yollara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir3.
GDO’ların konuşlandırılması endişesi olmadan mikroorganizma bazlı algılamanın faydalarından yararlanmak için güçlü bir yaklaşım, in vitro transkripsiyon / translasyon (IVTT) sistemlerinin kullanılmasıdır. Pratik bir bakış açısıyla, IVTT sistemleri, hücre bileşenlerinin çoğunu, sonikasyon, boncuk dövme veya diğerleri de dahil olmak üzere hücrelerden farklı yollarla “ekstrakte edilmiş” aktif bir durumda içeren bir karışımdan oluşur4. Bu işlemin nihai ürünü, tüm hücrelerin kullanımıyla ilişkili kısıtlamalar (membran difüzyonu, transformasyon verimliliği, hücre toksisitesi, vb.) olmaksızın, farklı sensörleri “açık kap” formatında test etmek için kullanılabilecek transkripsiyon ve translasyon gerçekleştirmek için zaten optimize edilmiş bir biyokimyasal reaksiyon karışımıdır. Önemli olarak, farklı sensör bileşenleri nicel olarak eklenebilir ve etkileri, gösterdiğimiz gibi farklı optik ve spektrometrik tekniklerle incelenebilir5. IVTT sistemlerinin performansının tutarsız olabileceği fark edilmiştir; Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, sensör tasarımı6’daki performanslarını incelerken çok yardımcı olan hazırlık ve karakterizasyonlarını standartlaştırmak için yaklaşımlar göstermiştir. Son zamanlarda, kağıt matrislerindeki bileşenlerinin liyofilizasyonu yoluyla kağıt bazlı tahliller oluşturmak için kullanılan IVTT sistemlerinin birçok örneği, ağır metal iyonlarının, ilaçların, çekirdek algılama elemanlarının ve diğerlerinin tespiti de dahil olmak üzere gösterilmiştir 7,8,9. IVTT tabanlı sensörler için heyecan verici bir uygulama alanı, toprak, su ve insan vücudu dahil olmak üzere farklı ortam türlerinde algılama uygulamalarında kullanılmasıdır. Bu IVTT sistemlerini bu zorlu ortamlara dağıtmak için, IVTT bileşenlerini içermek ve bozulmaya karşı korumak için bir kapsülleme yaklaşımının uygulanması gerekir.
IVTT sistemleri için en yaygın kapsülleme yaklaşımları, lipit kapsüllerin, misellerin, polimerzomların ve diğer sıkıca kapatılmış mikro kapların kullanımını içerir10,11,12. Bu yaklaşımın bir dezavantajı, dış çevre ile iletişime izin vermek ve algılama yetenekleri sağlamak için malzemeleri konteynerlerin içine ve dışına taşımak için pasif veya aktif mekanizmaların dahil edilmesi ihtiyacıdır. Bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için, buradaki çalışma, IVTT sistemlerinde ifade edilecek farklı sensör tasarımları için kodlama malzemelerini kapsüllemek için basit ama etkili bir yaklaşım sağlayan bir yöntem bildirmektedir. Bu yaklaşım, korunan genetik materyalin tercih edilen IVTT’nin farklı bileşenleri ile etkileşime girmesini sağlayan, yüksek gözenekliliğe sahip içi boş mikrokapsüller oluşturmak için ilgili plazmidlerin varlığında bir biyopolimerin Katman Katman (LbL) birikiminin kullanılmasına dayanmaktadır. Çalışma, kapsüllenmiş plazmidlerin, plazmid kodlu bir aptamer ve bir riboswitch’in karşılık gelen hedeflerine tepkisiyle gösterildiği gibi, bu polimerik matris içinde aktive edildiğinde transkripsiyon ve translasyonu yönlendirebileceğini göstermiştir. Ek olarak, bu LbL kaplama, plazmidleri herhangi bir özel depolama koşulu olmadan aylarca korur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolü takiben çeşitli DNA kodlu sensör tasarımları ile yüklenen seçici geçirgen hidrojel mikrokapsüller hazırlanabilir. LbL yaklaşımının ayırt edici özelliklerinden biri, genellikle moleküler türlerin kurban şablonları üzerinde adsorpsiyonuyla başlayan aşağıdan yukarıya montaj sırasında mikrokapsüllerin karmaşıklığını uyarlama yeteneğidir. İlk bileşenlerin konsantrasyonlarını, pH koşullarını ve katman sayısını dikkatlice ayarlayarak, farklı DNA yükleme parametreleri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi’nden LRIR 16RH3003J hibesi ve ABD Savunma Bakanlığı Araştırma ve Mühendislik Müsteşarlığı Ofisi’nin S&T Önceliklerinin Geliştirilmesi için Askeri Ortamlar için Sentetik Biyoloji Uygulamalı Araştırma (ARAP) programı ile desteklenmiştir.
ThyRS için plazmid vektör dizisi (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) Dr. J. Gallivan tarafından cömertçe sağlanmıştır. Bombyx mori’den ipekböceği kozaları, Tufts Üniversitesi, MA’dan Dr. D.L. Kaplan tarafından cömertçe bağışlandı.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
Riferimenti
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B., Reischl, U. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
