RNA 압타머 및 리보스위치를 인코딩하는 DNA 플라스미드가 로딩된 다기능 실크 기반 마이크로캡슐의 제조
Summary
이 프로토콜은 여러 리간드를 추적할 수 있는 다중화된 시험관 내 바이오센서로서 견고하고 생체적합성 DNA가 함유된 마이크로캡슐의 형성을 설명합니다.
Abstract
우리는 희생 구형 코어에서 층별(LbL) 조립 방법을 통해 DNA가 함유된 실크 피브로인 마이크로캡슐을 제조하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 프라임층 및 DNA 플라스미드의 흡착에 이어, 단일 실크층의 급성 탈수 동안 실크 2차 구조에서 β-시트를 유도함으로써 견고한 마이크로캡슐의 형성을 촉진하였다. 따라서 층상은 다중 수소 결합과 소수성 상호 작용을 통해 발생했습니다. 다층 쉘의 흡착 시, 코어-쉘 구조는 원격 감지 및/또는 표적 전달에 사용되는 금 나노입자(AuNP) 및/또는 항체(IgG)로 추가로 기능화될 수 있습니다. 폴리머 프라이머의 존재, DNA 및 실크 단백질의 농도, 다수의 흡착된 층과 같은 실리카 코어에 주요 거대분자를 순차적으로 증착하는 동안 몇 가지 주요 매개변수를 조정하면 다양한 투과성 및 DNA 로딩을 갖는 생체 적합성, DNA 함유 마이크로캡슐이 생성되었습니다. 실리카 코어의 용해 시, 프로토콜은 캡슐 멤브레인의 내부 표면에 고정된 DNA 플라스미드를 갖는 중공 및 견고한 마이크로캡슐의 형성을 입증하였다. DNA 플라스미드와 외부 환경 사이에 선택적으로 투과할 수 있는 생체적합성 막을 만들어 장기 보관 시 DNA를 보존하고 공간적으로 제한된 플라스미드의 출력 반응을 개선하는 데 중요한 역할을 했습니다. DNA 템플릿의 활성과 접근성은 시험관 내 전사 및 번역 반응(cell-free system) 동안 테스트되었습니다. RNA 라이트업 앱타머 및 리보스위치를 암호화하는 DNA 플라스미드는 쉘 막에서 형광 표지된 RNA 전사체 또는 GFPa1 단백질의 국소화 중에 시각화된 바와 같이 해당 분석물과 함께 성공적으로 활성화되었습니다.
Introduction
합성 생물학 분야는 미생물에 의해 진화된 자연적 메커니즘을 활용하여 환경과 잠재적 위협을 모니터링함으로써 감지 기능을 개발할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 중요하게도, 이러한 감지 메커니즘은 일반적으로 이러한 미생물을 유해한 노출로부터 보호하고 유전자 발현을 조절하여 부정적인 영향을 완화하거나 독성 물질의 섭취를 방지하는 반응과 관련이 있습니다. 이러한 자연 반응을 활용하지만 새로운 표적을 인식하거나 정량화 목적으로 측정할 수 있는 측정 가능한 신호(일반적으로 형광)를 생성하도록 방향을 바꾸도록 전체 세포 센서를 만들기 위해 이러한 미생물을 설계하려는 상당한 노력이 있었습니다1,2. 현재, 유전자 변형 미생물(GMO)의 사용에 대한 우려, 특히 환경이나 인체에서 방출될 때, 전체 세포 또는 일부 유전 물질의 누출로 인해, 폴리머 매트릭스에 캡슐화되어 있더라도 이러한 감지 접근법을 활용하기 위한 대안적인 방법이 필요함을 시사한다3.
GMO 배포에 대한 걱정 없이 미생물 기반 감지의 이점을 활용하는 강력한 접근 방식은 체외 전사/번역(IVTT) 시스템을 사용하는 것입니다. 실용적인 관점에서 IVTT 시스템은 초음파 처리, 비드 박동 또는 기타를 포함한 다양한 수단으로 세포에서 “추출”된 활성 상태의 대부분의 세포 구성 요소를 포함하는 혼합물로 구성됩니다4. 이 공정의 최종 산물은 전사 및 번역을 수행하도록 이미 최적화된 생화학 반응 혼합물로, 전체 세포 사용과 관련된 제약 없이(막 확산, 형질전환 효율, 세포 독성 등) “개방형 용기” 형식으로 다양한 센서를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 서로 다른 센서 구성 요소를 정량적으로 추가할 수 있고, 우리가 설명한 바와 같이 서로 다른 광학 및 분광 기술로 그 효과를 연구할 수 있다는것입니다 5. IVTT 시스템의 성능이 일관되지 않을 수 있음이 밝혀졌습니다. 그러나 최근 연구에서는 준비 및 특성화를 표준화하는 접근 방식을 보여주었으며, 이는 센서 설계6에서 성능을 연구할 때 큰 도움이 됩니다. 최근에, 중금속 이온, 약물, 정족수 감지 요소및 기타의 검출을 포함하여, 종이 매트릭스에서 그 성분들의 동결건조를 통해 종이-기반 분석법을 생성하기 위해 사용되는 IVTT 시스템의 많은 예들이 입증되었다 7,8,9. IVTT 기반 센서의 흥미로운 응용 분야는 토양, 물, 인체를 포함한 다양한 유형의 환경에서 감지 응용 분야에 사용된다는 것입니다. 이러한 IVTT 시스템을 이러한 까다로운 환경에 배포하려면 IVTT 구성 요소를 포함하고 성능 저하로부터 보호하기 위한 캡슐화 접근 방식을 구현해야 합니다.
IVTT 시스템에 대한 가장 일반적인 캡슐화 접근법은 지질 캡슐, 미셀, 폴리머솜 및 기타 밀접하게 밀폐된 마이크로컨테이너(10,11,12)의 사용을 포함한다. 이 접근 방식의 한 가지 단점은 외부 환경과의 통신을 허용하고 감지 기능을 제공하기 위해 컨테이너 안팎으로 재료를 운반하기 위해 수동 또는 능동 메커니즘을 통합해야 한다는 것입니다. 이러한 문제 중 일부를 극복하기 위해 이 연구에서는 IVTT 시스템에서 표현할 다양한 센서 설계에 대한 인코딩 재료를 캡슐화하는 간단하면서도 효과적인 접근 방식을 제공하는 방법을 보고합니다. 이 접근법은 관심 플라스미드의 존재 하에 바이오폴리머의 층별(LbL) 증착을 사용하여 높은 다공성을 가진 중공 마이크로캡슐을 생성함으로써 보호된 유전 물질이 선택한 IVTT의 다양한 구성 요소와 상호 작용할 수 있도록 합니다. 이 연구는 캡슐화된 플라스미드가 플라스미드 인코딩된 앱타머 및 해당 표적에 대한 리보스위치의 반응에서 볼 수 있듯이 이 고분자 매트릭스 내에서 활성화될 때 전사 및 번역을 지시할 수 있음을 입증했습니다. 또한 이 LbL 코팅은 특별한 보관 조건 없이 몇 달 동안 플라스미드를 보호합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다양한 유형의 DNA-인코딩된 센서 설계로 로딩된 선택적 투과성 하이드로겔 마이크로캡슐은 이 프로토콜에 따라 제조될 수 있다. LbL 접근법의 특징 중 하나는 상향식 조립 동안 마이크로 캡슐의 복잡성을 조정할 수 있다는 것인데, 이는 일반적으로 희생 템플릿에 분자 종의 흡착으로 시작됩니다. 초기 성분의 농도, pH 조건 및 층수를 조심스럽게 조절함으로써, 상이한 DNA 로딩 파라미터, 기능성 및 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 공군 과학 연구실의 LRIR 16RH3003J 보조금과 미국 국방부 연구 및 공학 차관실의 ARAP (Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S & T Priorities) 프로그램의 지원을 받았습니다.
ThyRS에 대한 플라스미드 벡터 서열(pSALv-RS-GFPa1, 3.4kb)은 J. Gallivan 박사에 의해 아낌없이 제공되었습니다. Bombyx mori 의 누에 고치는 매사추세츠주 터프츠 대학교의 D.L. Kaplan 박사가 아낌없이 기증했습니다.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
Riferimenti
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