Monitoreo del ciclo estral de roedores utilizando lavado vaginal: no hay tal cosa como un ciclo normal
Summary
Este estudio detalla los factores cruciales a considerar en diseños experimentales que involucran ratas hembras. En un sentido más amplio, estos datos sirven para disminuir el estigma y ayudar en el desarrollo de herramientas de diagnóstico e intervención más inclusivas.
Abstract
La metodología actual establece un enfoque reproducible, estandarizado y rentable para monitorear el ciclo estral de las ratas adolescentes hembra Sprague Dawley (SD). Este estudio demuestra la complejidad de los ciclos hormonales y el amplio espectro de comprensión requerido para construir una técnica de monitoreo confiable y válida. A través de un examen en profundidad de los principales elementos de diseño experimental y procedimiento, esta descripción del ciclo y sus principios fundamentales proporciona un marco para una mayor comprensión y deconstruye conceptos erróneos para su futura replicación.
Junto con un esquema del proceso de recolección de muestras que emplea el lavado vaginal, el procedimiento describe el mecanismo de categorización de datos en el modelo de cuatro etapas de proestro, estro, metestro y diestro. Estas etapas se caracterizan por un nuevo enfoque propuesto, utilizando los 4 determinantes de categorización de la condición del fluido vaginal, tipo (s) de célula (s) presente, disposición celular y cantidad de células en el momento de la recolección. Las variaciones de cada etapa, las muestras favorables y desfavorables, la distinción entre ciclicidad y aciclicidad, y las representaciones gráficas de los componentes de categorización recopilados se presentan junto con prácticas interpretativas y organizativas efectivas de los datos. En general, estas herramientas permiten la publicación de rangos de datos cuantificables por primera vez, lo que lleva a la estandarización de los factores de categorización tras la replicación.
Introduction
Contribuciones novedosas
El ciclo estral de roedores ha sido identificado como un indicador esencial de bienestar. Sin embargo, los sesgos inconscientes de los investigadores y las interpretaciones inexactas con respecto al cuerpo femenino obstaculizan a la comunidad científica. La etimología misma de la palabra “estro” implica un sentido de inferioridad y negatividad. Eurípides usó el término para describir un “frenesí” o locura, Homero para describir el pánico y Platón para describir un impulso irracional. Este estudio destaca cómo estas perspectivas primigenias influyen en la comunidad científica actual y aborda estas preocupaciones a través de un nuevo paradigma de mosaico: una combinación actualizada de métodos previamente estudiados, ampliados en alcance para un enfoque más integral.
El estudio y el uso de esta técnica son necesarios, en primer lugar, ya que no existe una técnica de monitoreo estandarizada y completa, y las prácticas de interpretación de datos pueden no estar claras. En segundo lugar, aunque las características del ciclo estral dependen de las ratas individuales que se están estudiando, a menudo se universalizan. En tercer lugar, si bien los ciclos hormonales son procesos rutinarios y beneficiosos, están rodeados de estigmas peligrosos explorados en la sección “Traducción a humanos”. Este estudio tiene como objetivo abordar estos tres problemas de tres maneras: (A) describiendo una técnica de monitoreo del ciclo estral en profundidad y aclarando cómo se pueden interpretar los resultados, (B) delineando métodos que mantienen la integridad e individualidad de cada ciclo, y (C) llamando la atención sobre conceptos erróneos que perpetúan prácticas sin fundamento.
Este estudio también es único en su enfoque en ratas adolescentes, un período marcado por cambios cruciales en el desarrollo que arrojan luz sobre diversas manifestaciones conductuales, anatómicas y fisiológicas en la edad adulta1. La construcción de un diseño experimental estandarizado para monitorear los ciclos hormonales en una población poco investigada mientras se deconstruyen los sesgos comunes permitirá el desarrollo de correlaciones hormonales confiables y válidas 2,3,4 y la determinación de interrupciones del ciclo dependientes de la condición 5,6,7,8,9,10 . En última instancia, estas novedades sirven para ampliar los criterios de diagnóstico, tratamientos e intervenciones de diversas preocupaciones de bienestar.
Definiciones y usos fundamentales
El ciclo estral es una colección de procesos fisiológicos dinámicos que ocurren en respuesta a las tres hormonas esteroides sexuales femeninas oscilantes: estradiol, hormona leuteinizante (LH) y progesterona (Figura 1A, B). Las interacciones entre el sistema endocrino y el sistema nervioso central regulan el ciclo, que con mayor frecuencia persiste durante 4-5 días y se repite desde el inicio de la maduración sexual hasta la senescencia reproductiva y / o el cese. Se divide en categorías separadas basadas en los niveles hormonales, más comúnmente en las 4 etapas de diestro (DIE), proestro (PRO), estro (EST) y metestro (MET), que progresan de manera circular. El número de divisiones puede variar de 3 etapas11 a 13 etapas12, dependiendo de la naturaleza del estudio13. El menor número de divisiones a menudo excluye el MET como una etapa y lo clasifica como un período de transición de corta duración. El número más alto generalmente incluye subsecciones que permiten una inspección más cercana de fenómenos como el desarrollo tumoral o el pseudoembarazo espontáneo, el estado fisiológico del embarazo sin implantación embrionaria 12,14,15.
En este estudio, las etapas se identificaron a través de componentes del canal vaginal, llamados los 3 determinantes de categorización: tipo(s) de célula(s) presente(s), disposición celular y cantidad de células (Figura 2A-D). Si bien la condición del fluido vaginal no se monitoreó en este estudio, se recomienda incluirlo como un cuarto componente de categorización. Se puede encontrar más información sobre el examen del fluido vaginal en la lista dereferencias 16. Los componentes de categorización se pueden examinar mediante la extracción de células a través del lavado vaginal, la técnica principal recomendada en el monitoreo del ciclo estral moderno. Si bien los procesos fisiológicos en profundidad dentro de cada etapa están fuera del alcance de este estudio, se puede encontrar más información en la literatura17.
El uso y desarrollo continuo de esta técnica de monitoreo del ciclo estral se basa en las conexiones entre las hormonas esteroides sexuales y la función de los sistemas corporales como el sistema cardiovascular18, el sistema endocrino8 y el sistema nervioso central 19,20,21. Al mismo tiempo, el monitoreo del ciclo estral puede no ser siempre necesario cuando los roedores hembra están involucrados 22,23,24,25. Más bien, es importante considerar primero si se han reportado diferencias de sexo en el área específica de estudio, que pueden explorarse más a fondo en las revisiones publicadas22,23. Aunque el monitoreo del ciclo estral es vital en un amplio espectro de investigaciones de investigación, no debe verse como un obstáculo para incluir roedores hembra en los experimentos. Si bien esta técnica puede parecer compleja y llevar mucho tiempo, el procedimiento en sí puede tardar menos de 15 minutos en completarse, dependiendo del investigador, y es rentable. En general, la inclusión de roedores hembra en estudios científicos es ventajosa para la comprensión de los sistemas corporales, diversas afecciones y patologías, y el bienestar general, ya que estos desarrollos se han basado principalmente en la plantilla corporal masculina.
Parámetros universales y variabilidades naturales en el roedor
El establecimiento de rangos para aspectos vistos como “típicos” es necesario para definir patrones de ciclo estándar, establecer parámetros con fines comparativos y analíticos, y detectar anomalías y valores atípicos. Al mismo tiempo, también es importante reconocer que el ciclo de cada rata es único, y se esperan desviaciones basadas en la tensión animal, los procesos fisiológicos y las condiciones ambientales. De hecho, uno de los aspectos más “normales” del ciclo estral es la variabilidad. Esto se ve en la duración total del ciclo, con un rango de 3-38 días 26,27; la edad de maduración sexual que puede variar de 32-34 días a múltiples semanas 28,29,30; lo que se considera acíclico11, y los patrones determinantes de categorización 11,13. En general, no existe una plantilla universal para el ciclo estral, y traducir eso tanto a la comunidad científica como al público en general es una parte importante del proceso experimental.
Puntos de tiempo experimentales y edad de desarrollo
Reconocer este principio de variabilidad ayuda a construir un diseño experimental confiable y válido. Por ejemplo, el inicio del monitoreo del ciclo estral se basa en el desarrollo anatómico y fisiológico de las ratas, que varía según los factores ambientales y fisiológicos. El monitoreo no puede comenzar hasta el desarrollo de la abertura vaginal (VO), que es el orificio vaginal externo rodeado por la vulva que conduce a la porción interior del canal vaginal (Figura 3A-D). Si bien el VO a menudo se desarrolla completamente entre las edades de 32 y 34 días, permanece individualizado para cada sujeto, y mucho sobre el proceso sigue siendo desconocido. Esta abertura se ha utilizado para identificar el inicio de la maduración sexual, que se ha relacionado con el aumento del estradiol31, la maduración del eje hipotalámico-hipofisario-ovárico32 y la primera ovulación en ratas 17,33,34,35. Sin embargo, publicaciones recientes han encontrado que es solo un marcador indirecto del desarrollo reproductivo, ya que puede desacoplarse de las ocurrencias hormonales y de desarrollo en ambientes desfavorables31 y puede representar cambios en los niveles de estradiol en lugar de la maduración sexual33. Por lo tanto, se recomienda no confiar únicamente en el VO para determinar la edad de desarrollo y como calificador para el monitoreo del ciclo estral36, sino también utilizar la aparición de la primera etapa EST y la cornificación de las células epiteliales30 para marcar el inicio de la maduración sexual.
El peso corporal se correlaciona notablemente con la edad de desarrollo durante el período adolescente en roedores30,37 y, por lo tanto, también puede ayudar a determinar la edad de desarrollo en este período. Los mecanismos propuestos relacionados con este fenómeno incluyen la estimulación de hormonas necesarias para el desarrollo reproductivo, como la hormona del crecimiento, y la inhibición del eje suprarrenal hipotalámico-hipofisario (HPA) por el regulador del apetito, la leptina30. Sin embargo, no se recomienda utilizar esta medida como el único indicador de la edad de desarrollo debido a la gran varianza observada entre las ratas entre las especies y los proveedores de proveedores38. La variabilidad observada en el desarrollo de la VO y el peso corporal ejemplifican la importancia del concepto en el proceso experimental general.
Traducción a humanos: contextos culturales y científicos
La relación traslacional de los estudios reproductivos de animales a humanos es bidireccional. Los resultados de estudios basados en animales influyen en cómo se evalúan, abordan y analizan los procesos humanos39. La percepción del sistema reproductivo humano y sus procesos relacionados influyen en cómo se estudian los animales. De hecho, una de las indicaciones más fuertes para futuras investigaciones en esta área proviene de creencias socioculturales sesgadas relacionadas con los ciclos hormonales que influyen en el proceso científico. Muchas de estas convenciones se derivan de una aversión cultural general a discutir la menstruación, lo que ha llevado a una brecha de datos en el conocimiento bien fundamentado40,41. Esto tiene un espectro de consecuencias que van desde menores hasta letales, desde la altura de las estanterías y el tamaño del teléfono inteligente hasta el ajuste de la armadura corporal de la policía y los diagnósticos de cáncer perdidos42.
La descripción de la menstruación como insalubre, destructiva y tóxica, vista en textos venerados, medios de comunicación, diccionarios y enseñanzas médicas, se conserva en publicaciones científicas. Esto ocurre a través de descripciones inexactas y sesgadas de los ciclos hormonales, el aislamiento del sistema reproductivo de sus contrapartes neuroendocrinas e influencias ambientales, y la perspectiva reduccionista de la finalización de un ciclo como un “fracaso en la concepción”43,44. Esto conduce a la creación de prácticas experimentales poco sólidas, como la omisión de variables externas que influyen en los ciclos hormonales, la determinación de los inicios y puntos finales basados únicamente en los desarrollos anatómicos y la medición del avance del ciclo de una manera lineal en lugar de circular. A pesar de la correlación directa entre los factores socioculturales y las consecuencias biológicas, a menudo no se considera en la literatura científica. A través de la inspección de publicaciones más holísticas 43,44,45, los investigadores pueden deconstruir estos estigmas y crear diseños experimentales más confiables y válidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos clave y consideraciones importantes
Ciertos pasos críticos en el protocolo proporcionado requieren énfasis, especialmente dentro de la recolección de células vaginales. Durante la extracción de líquido vaginal, garantizar el ángulo y la profundidad adecuados de la inserción de la jeringa es clave para producir resultados satisfactorios y, en última instancia, prevenir la irritación, lesiones o estimulación cervical del animal. La estimulación del cuello uterino puede ser una fuente d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio se realizó a través de una colaboración financiada por los NIH entre el Centro de Investigación de Lesiones Cerebrales de la Universidad de California en Los Ángeles (BIRC).
Materials
| AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera | AmScope | Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5 | https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15 |
| BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel | Fischer Scientific | 14-815-526 | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201 |
| Bed O Cob 1/8 | NEWCO | 93009 | https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/ |
| Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass | Fischer Scientific | 12-553-7A | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a |
| Corning™ Rectangular Cover Glasses | Fischer Scientific | 12-553-464 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true |
| Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fischer Scientific | 06-666 | https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes |
| Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001 | NEWCO Specialty and LabDiet | 5012 | https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html |
| Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm | Grainger | 36UX10 | https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC |
| Sodium Chloride Injection Bags, 0.9% | Live Action Safety | ABB079830939 | https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/ |
| Syringe Sterile 1ml with Luer Slip Tip – 100 Syringes by BH Supplies | BH Supplies | ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821 | https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ== |
| Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen | Allentown | LV40326013 | https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description |
| Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad | Medline | EAN: 0480196288558 Global Trade Identification Number: 40080196288558 |
https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4 |
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