L’obiettivo di questo protocollo è quello di sviluppare un sistema modello per l’effetto dell’iperossia sulle comunità microbiche delle vie aeree della fibrosi cistica. Il mezzo espettorato artificiale emula la composizione dell’espettorato e le condizioni di coltura iperossica modellano gli effetti dell’ossigeno supplementare sulle comunità microbiche polmonari.
Si ritiene che le comunità microbiche delle vie aeree svolgano un ruolo importante nella progressione della fibrosi cistica (FC) e di altre malattie polmonari croniche. I microbi sono stati tradizionalmente classificati in base alla loro capacità di utilizzare o tollerare l’ossigeno. L’ossigeno supplementare è una terapia medica comune somministrata a persone con fibrosi cistica (pwCF); tuttavia, gli studi esistenti sull’ossigeno e sul microbioma delle vie aeree si sono concentrati su come l’ipossia (basso livello di ossigeno) piuttosto che l’iperossia (alto livello di ossigeno) colpisce le comunità microbiche polmonari anaerobiche prevalentemente aerobiche e facoltative. Per affrontare questa lacuna critica di conoscenza, questo protocollo è stato sviluppato utilizzando un mezzo espettorato artificiale che imita la composizione dell’espettorato da pwCF. L’uso della sterilizzazione con filtro, che produce un mezzo trasparente, consente ai metodi ottici di seguire la crescita di microbi unicellulari in colture in sospensione. Per creare condizioni iperossiche, questo sistema modello sfrutta le tecniche di coltivazione anaerobica consolidate per studiare le condizioni iperossiche; invece di rimuovere l’ossigeno, l’ossigeno viene aggiunto alle colture mediante spargimento quotidiano di flaconi di siero con una miscela di ossigeno compresso e aria. L’espettorato da 50 pwCF è stato sottoposto a sparging giornaliero per un periodo di 72 ore per verificare la capacità di questo modello di mantenere condizioni di ossigeno differenziale. Il sequenziamento metagenomico shotgun è stato eseguito su campioni di espettorato in coltura e non coltivati da 11 pwCF per verificare la capacità di questo mezzo di supportare la crescita di microbi commensali e patogeni comunemente presenti nell’espettorato della fibrosi cistica. Le curve di crescita sono state ottenute da 112 isolati ottenuti da pwCF per verificare la capacità di questo mezzo espettorato artificiale di supportare la crescita di comuni patogeni della fibrosi cistica. Troviamo che questo modello può coltivare un’ampia varietà di agenti patogeni e commensali nell’espettorato CF, recupera una comunità molto simile all’espettorato non coltivato in condizioni normossiche e crea diversi fenotipi di coltura in condizioni di ossigeno variabili. Questo nuovo approccio potrebbe portare a una migliore comprensione degli effetti imprevisti indotti dall’uso di ossigeno in pwCF sulle comunità microbiche delle vie aeree e sui comuni patogeni respiratori.
La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica caratterizzata dall’incapacità di eliminare il muco denso dai polmoni, che porta a infezioni ripetute e progressivo declino della funzione polmonare che spesso si traduce nella necessità di trapianto di polmone o morte. Il microbioma delle vie aeree delle persone con fibrosi cistica (pwCF) sembra tracciare l’attività della malattia1, con una riduzione della diversità microbica associata a esiti avversi a lungo termine2,3. Negli studi clinici di pwCF, l’ossigenoterapia supplementare è stata associata alla malattia più avanzata4,5, anche se tradizionalmente, l’uso dell’ossigenoterapia è stato visto semplicemente come un marcatore per la gravità della malattia6. Recenti studi di uno studio clinico su pazienti con insufficienza respiratoria hanno dimostrato che livelli più elevati di ossigeno nei pazienti sono paradossalmente associati ad un aumento delle infezioni batteriche gravi e ad una maggiore mortalità7, suggerendo che l’ossigeno supplementare può contribuire alla patogenesi della malattia. L’effetto dell’ossigeno supplementare sul microbioma polmonare della fibrosi cistica e sulle comunità microbiche polmonari e aeree associate non è stato ben studiato.
Gli studi meccanicistici spesso non possono essere eseguiti direttamente su soggetti umani a causa di difficoltà logistiche e potenziali problemi etici associati a interventi di beneficio o danno medico sconosciuto. Gli approcci traslazionali che integrano i biocampioni umani in sistemi modello possono offrire importanti intuizioni biologiche in questi casi. Mentre la capacità di utilizzare o tollerare l’ossigeno è stata tradizionalmente una componente importante della classificazione microbica, poco si sa su come l’introduzione terapeutica di ossigeno supplementare nell’ambiente potrebbe perturbare le comunità microbiche delle vie aeree. Per far luce sugli effetti sconosciuti dell’ossigeno supplementare sui microbiomi delle vie aeree di pwCF, dovevamo affrontare due sfide principali; in primo luogo, la creazione di un terreno di coltura che approssima fisiologicamente la composizione dell’espettorato CF; in secondo luogo, la creazione di un sistema modello che consenta il mantenimento di elevate concentrazioni di ossigeno in coltura per lunghi periodi di tempo.
I mezzi di espettorato artificiale (ASM) sono ampiamente utilizzati per emulare l’espettorato polmonare ex vivo8,9,10, ma non esiste un chiaro consenso su una ricetta specifica. Questo protocollo descrive una ricetta e una strategia di preparazione del mezzo espettorato artificiale attentamente progettata per approssimare fisiologicamente l’espettorato da pwCF. La Tabella 1 delinea i valori delle ricette scelte in base alla letteratura pubblicata. I componenti chimici di base e il pH sono stati abbinati ai valori identificati dagli studi sull’espettorato CF umano11,12,13. Nutrienti fisiologici a bassa concentrazione sono stati aggiunti utilizzando il tuorlo d’uovo, che è stato incluso come 0,25% del volume finale10, così come le miscele di vitamine e traccemetalliche 14,15. La mucina, il componente chiave dell’espettorato16,è stata inclusa all’1% p/v14. Sebbene più laboriosa, la sterilizzazione con filtro è stata scelta rispetto alla pratica più convenzionale della sterilizzazione a caldo per ridurre i potenziali problemi derivanti dalla denaturazione indotta dal calore dei componenti essenziali dei mezzi10. Un ulteriore vantaggio della sterilizzazione con filtro è che genera mezzi trasparenti (la sterilizzazione a caldo può creare mezzi torbidi a causa della precipitazione e della coagulazione di sali e proteine), consentendo a questo mezzo espettorato artificiale di essere utilizzato per seguire la crescita microbica in base all’aumento della torbidità.
Questo sistema modello per la coltura iperossica si basa su tecniche di coltivazione anaerobica in cui l’ossigeno viene aggiunto piuttosto che rimosso, creando un modello per l’effetto dell’uso supplementare di ossigeno per pwCF. La Figura 1 e il protocollo di sparging dell’ossigeno associato delineano i componenti di un sistema di sparging di ossigeno, che può essere ottenuto a basso costo da fornitori generali di laboratorio e ospedalieri. Questo sistema consente la miscelazione di ossigeno compresso e aria a concentrazioni fisse che vanno dal 21% al 100% di ossigeno. L’integrazione di un sensore di ossigeno consente la verifica della concentrazione della miscela di gas in uscita, nonché il controllo della composizione del gas di deflusso di bombole di siero precedentemente spargate per verificare che le condizioni di ossigeno siano state mantenute entro l’intervallo desiderato.
Questo protocollo delinea le procedure per creare un mezzo espettorato artificiale, la costruzione e l’uso di un sistema di spargimento di ossigeno e l’applicazione di entrambi per coltivare l’espettorato CF in condizioni di ossigeno differenziale.
In questo studio, è stato sviluppato un modello in vitro per studiare l’effetto dell’iperossia sulle comunità microbiche polmonari. Questo modello, basato sul mezzo espettorato artificiale e sullo spargimento giornaliero di flaconi di siero, mantiene elevate concentrazioni di ossigeno e supporta la crescita dei microbi identificati nell’espettorato da pwCF.
Ci sono diversi passaggi critici di questo approccio. Il primo è la scelta di utilizzare la sterilizzazione con filtro piuttos…
The authors have nothing to disclose.
Parte di questo lavoro è stato eseguito presso il Marine Biological Lab con il supporto del Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (numero di sovvenzione 5600373) e un dono della Simons Foundation.
BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |