Проектирование и разработка модели для изучения влияния дополнительного кислорода на микробиом дыхательных путей муковисцидоза
Summary
Целью данного протокола является разработка модельной системы влияния гипероксии на микробные сообщества дыхательных путей муковисцидоза. Искусственная среда мокроты имитирует состав мокроты, а гипероксичные условия культуры моделируют воздействие дополнительного кислорода на микробные сообщества легких.
Abstract
Считается, что микробные сообщества дыхательных путей играют важную роль в прогрессировании муковисцидоза (МВ) и других хронических заболеваний легких. Микробы традиционно классифицируются на основе их способности использовать или переносить кислород. Дополнительный кислород является распространенной медицинской терапией, назначаемой людям с муковисцидозом (pwCF); однако существующие исследования кислорода и микробиома дыхательных путей были сосредоточены на том, как гипоксия (низкий уровень кислорода), а не гипероксия (высокий уровень кислорода) влияет на преимущественно аэробные и факультативные анаэробные микробные сообщества легких. Чтобы устранить этот критический пробел в знаниях, этот протокол был разработан с использованием искусственной среды мокроты, которая имитирует состав мокроты из pwCF. Использование фильтрующей стерилизации, которая дает прозрачную среду, позволяет оптическими методами следить за ростом одноклеточных микробов в культурах суспензии. Для создания гипероксических условий эта модельная система использует установленные методы анаэробного культивирования для изучения гипероксических состояний; вместо удаления кислорода кислород добавляют в культуры путем ежедневного разбрызгивания сывороточных баллонов смесью сжатого кислорода и воздуха. Мокрота от 50 pwCF подвергалась ежедневному спаррингу в течение 72-часового периода, чтобы проверить способность этой модели поддерживать дифференциальные кислородные условия. Метагеномное секвенирование дробовика проводили на культивируемых и некультурных образцах мокроты из 11 pwCF для проверки способности этой среды поддерживать рост комменсальных и патогенных микробов, обычно встречающихся в мокроте муковисцидоза. Кривые роста были получены из 112 изолятов, полученных из pwCF, для проверки способности этой искусственной среды мокроты поддерживать рост распространенных патогенов муковисцидоза. Мы обнаружили, что эта модель может культивировать широкий спектр патогенов и комменсалов в мокроте муковисцидоза, восстанавливает сообщество, очень похожее на некультурную мокроту в нормоксических условиях, и создает различные фенотипы культуры в различных кислородных условиях. Этот новый подход может привести к лучшему пониманию непредвиденных эффектов, вызванных использованием кислорода в pwCF, на микробные сообщества дыхательных путей и распространенные респираторные патогены.
Introduction
Муковисцидоз (МВ) является генетическим заболеванием, характеризующимся неспособностью очищать густую слизь из легких, что приводит к повторным инфекциям и прогрессирующему снижению функции легких, что часто приводит к необходимости трансплантации легких или смерти. Микробиом дыхательных путей людей с муковисцидозом (pwCF), по-видимому, отслеживает активность заболевания1с уменьшением микробного разнообразия, связанного с неблагоприятными долгосрочными исходами2,3. В клинических исследованиях pwCF дополнительная кислородная терапия была связана с более продвинутым заболеванием4,5,хотя традиционно использование кислородной терапии рассматривалось просто как маркер тяжести заболевания6. Недавние исследования из клинического испытания пациентов с дыхательной недостаточностью показали, что более высокие уровни кислорода у пациентов парадоксальным образом связаны с увеличением серьезных бактериальных инфекций и более высокой смертностью7,предполагая, что дополнительный кислород может способствовать патогенезу заболевания. Влияние дополнительного кислорода на микробиом легкого муковисцидоза и связанные с ним микробные сообщества легких и дыхательных путей не было хорошо изучено.
Механистические исследования часто не могут быть выполнены непосредственно на людях из-за логистических трудностей и потенциальных этических проблем, связанных с вмешательствами с неизвестной медицинской пользой или вредом. Трансляционные подходы, которые интегрируют биообразцы человека в модельные системы, могут предложить важную биологическую информацию в этих случаях. Хотя способность использовать или переносить кислород традиционно была важным компонентом микробной классификации, мало что известно о том, как терапевтическое введение дополнительного кислорода в окружающую среду может нарушить микробные сообщества дыхательных путей. Чтобы пролить свет на неизвестное влияние дополнительного кислорода на микробиомы дыхательных путей pwCF, нам нужно было решить две основные проблемы; во-первых, создание питательной среды, физиологически аппроксимирующей состав мокроты МВ; во-вторых, создание модельной системы, позволяющей поддерживать повышенные концентрации кислорода в культуре в течение длительных периодов времени.
Искусственные среды мокроты (ASM) широко используются для эмуляции мокроты легких ex vivo8,9,10,но нет четкого консенсуса по конкретному рецепту. Этот протокол описывает рецепт искусственной мокроты и стратегию приготовления, тщательно разработанную для физиологически аппроксимации мокроты из pwCF. В таблице 1 приведены значения выбранных рецептов на основе опубликованной литературы. Основные химические компоненты и рН были сопоставлены со значениями, выявленными исследованиями человеческого МВ мокроты11,12,13. Низкоконцентрированные физиологические питательные вещества добавляли с использованием яичного желтка, который включался в виде 0,25% от конечного объема10,а также смеси витаминов и микрометаллов14,15. Муцин, ключевой компонент мокроты16,был включен в 1% мас./v14. Несмотря на то, что фильтрация является более трудоемкой, стерилизация фильтров была выбрана вместо более традиционной практики тепловой стерилизации для уменьшения потенциальных проблем, связанных с термоиндуцированной денатурацией основных компонентов среды10. Дополнительным преимуществом фильтрационной стерилизации является то, что она генерирует прозрачные среды (теплостерилизация может создавать мутные среды из-за осаждения и коагуляции солей и белков), что позволяет использовать эту искусственную среду мокроты для отслеживания роста микробов на основе увеличения мутности.
Эта модельная система для гипероксической культуры основана на методах анаэробного культивирования, где кислород добавляется, а не удаляется, создавая модель эффекта дополнительного использования кислорода для pwCF. На рисунке 1 и связанном с ним протоколе разбрызгивания кислорода описываются компоненты кислородной разбрызгивающей системы, которые могут быть получены при низких затратах от общих лабораторных и больничных поставщиков. Эта система позволяет смешивать сжатый кислород и воздух с фиксированными концентрациями в диапазоне от 21% до 100% кислорода. Интеграция датчика кислорода позволяет проверить концентрацию выходной газовой смеси, а также проверить газовый состав оттока ранее разрозненных сывороточных баллонов, чтобы убедиться, что кислородные условия поддерживались в желаемом диапазоне.
В этом протоколе описываются процедуры создания искусственной мокроты, построение и использование системы разбрызгивания кислорода, а также применение обоих для культивирования мокроты CF в дифференциальных кислородных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании была разработана модель in vitro для изучения влияния гипероксии на микробные сообщества легких. Эта модель, основанная на искусственной среде мокроты и ежедневном разбрызгивании сывороточных баллонов, поддерживает повышенные концентрации кислорода и поддержив…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Часть этой работы была выполнена в Морской биологической лаборатории при поддержке Морской биологической лаборатории, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (номер гранта 5600373) и подарком от Фонда Саймонса.
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
Riferimenti
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model – An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , (2010).
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicina. 96 (47), 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta’omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
