In dieser Arbeit beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zum Testen des mitochondrialen respiratorischen Substratflusses unter Verwendung von rekombinantem Perfringolysin O in Kombination mit mikroplattenbasierter Respirometrie. Mit diesem Protokoll zeigen wir, wie Metformin die mitochondriale Atmung von zwei verschiedenen Tumorzelllinien beeinflusst.
Der mitochondriale Substratfluss ist ein Unterscheidungsmerkmal jedes Zelltyps, und Veränderungen seiner Komponenten wie Transporter, Kanäle oder Enzyme sind an der Pathogenese mehrerer Krankheiten beteiligt. Mitochondrialer Substratfluss kann mit intakten Zellen, permeabilisierten Zellen oder isolierten Mitochondrien untersucht werden. Die Untersuchung intakter Zellen stößt aufgrund der gleichzeitigen Oxidation verschiedener Substrate auf mehrere Probleme. Außerdem enthalten mehrere Zelltypen interne Speicher verschiedener Substrate, die die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Methoden wie die mitochondriale Isolierung oder die Verwendung von Permeabilisatoren sind nicht leicht reproduzierbar. Die Isolierung reiner Mitochondrien mit intakten Membranen in ausreichenden Mengen aus kleinen Proben ist problematisch. Die Verwendung von nicht-selektiven Permeabilisatoren verursacht verschiedene Grade unvermeidlicher mitochondrialer Membranschäden. Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde dank seiner Fähigkeit, die Plasmamembran selektiv zu permeabilisieren, ohne die mitochondriale Integrität zu beeinträchtigen, als geeigneterer Permeabilisator angeboten. In Kombination mit der Mikroplatten-Respirometrie ermöglicht es, den Fluss mehrerer mitochondrialer Substrate mit genügend Replikaten innerhalb eines Experiments unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Zellen zu testen. In dieser Arbeit beschreibt das Protokoll eine Methode zum Vergleich des mitochondrialen Substratflusses von zwei verschiedenen zellulären Phänotypen oder Genotypen und kann angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Substrate oder Inhibitoren zu testen.
Die Mikroplatten-basierte Respirometrie hat die mitochondriale Forschung revolutioniert, indem sie die Untersuchung der Zellatmung einer kleinen Stichprobengrößeermöglicht 1. Die Zellatmung wird im Allgemeinen als Indikator für die mitochondriale Funktion oder “Dysfunktion” angesehen, obwohl der mitochondriale Funktionsumfang über die Energieproduktion hinausgeht2. Unter aeroben Bedingungen extrahieren Mitochondrien die in verschiedenen Substraten gespeicherte Energie, indem sie diese Substrate abbauen und in metabolische Zwischenprodukte umwandeln, die den Zitronensäurezyklus3 antreiben können (Abbildung 1). Der kontinuierliche Fluss von Substraten ist essentiell für den Fluss des Zitronensäurezyklus, um hochenergetische “Elektronendonatoren” zu erzeugen, die Elektronen an die Elektronentransportkette liefern, die einen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran erzeugt, so dass die ATP-Synthase ADP zu ATP4phosphorylieren kann. Daher muss ein experimentelles Design zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung die Probennatur (intakte Zellen, permeabilisierte Zellen oder isolierte Mitochondrien) und mitochondriale Substrate umfassen.
Zellen halten einen Vorrat an einheimischen Substraten5, und Mitochondrien oxidieren mehrere Arten von Substraten gleichzeitig6, was die Interpretation von Ergebnissen aus Experimenten an intakten Zellen erschwert. Ein gängiger Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Fähigkeit, ein ausgewähltes Substrat zu oxidieren, besteht darin, Mitochondrien zu isolieren oder die untersuchten Zellen zu permeabilisieren5. Obwohl isolierte Mitochondrien ideal für quantitative Studien sind, ist der Isolationsprozess mühsam. Es steht vor technischen Schwierigkeiten wie der Notwendigkeit eines großen Stichprobenumfangs, der Reinheit der Ausbeute und der Reproduzierbarkeit der Technik5. Permeabilisierte Zellen bieten eine Lösung für die Nachteile der mitochondrialen Isolierung; Routinemäßige Permeabilisatoren der Detergenziennatur sind jedoch nicht spezifisch und können die mitochondrialen Membranen schädigen5.
Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde als selektives Plasmamembranpermeabilisierungsmittel7angeboten und in mehreren Studien7,8,9,10erfolgreich in Kombination mit einem extrazellulären Flussmittelanalysator eingesetzt . Wir haben ein Protokoll mit rPFO modifiziert, um den mitochondrialen Substratfluss mit dem extrazellulären Flussanalysator XFe96 zu screenen. In diesem Protokoll werden vier verschiedene Substratoxidationswege in zwei zellulären Phänotypen verglichen, während ausreichende Replikate und die richtige Kontrolle für jedes getestete Material vorhanden sind.
Dieses Protokoll ist eine Modifikation der zuvor veröffentlichten Studien7,8,9,10 und des Produkt-Benutzerhandbuchs. Im Gegensatz zum Protokoll des Herstellers wird anstelle von 3x MAS 2x MAS verwendet, da 2× MAS leichter aufzulösen ist und nach dem Einfrieren keine Ausfällungen bildet. Gefrorene 2x MAS Aliquots können bis zu sechs Monate gelagert werden und zeigen konsistente Ergebnisse. …
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für Physiologie an der Medizinischen Fakultät in Hradec Králové und der Abteilung für Pathophysiologie der Dritten Medizinischen Fakultät für die Hilfe bei chemikalien und Probenvorbereitung. Diese Arbeit wurde durch die Stipendienprogramme der Karlsuniversität PROGRES Q40/02, den Zuschuss des tschechischen Gesundheitsministeriums NU21-01-00259, den Zuschuss der tschechischen Wissenschaftsstiftung 18-10144 und das INOMED-Projekt CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 unterstützt, das vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik und von der Europäischen Union finanziert wurde.
Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
Water | Merck | W3500 | store at RT |
XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |