مقايسات نقل طاقة الرنين Förster التي تم حلها بمرور الوقت لقياس بروتينات STAT المفسفرة الداخلية في الخلايا البشرية
Summary
يتم وصف بروتوكولات الفحص الخلوي القائم على خلايا نقل طاقة Förster التي تم حلها عبر الزمن من أجل التحديد الكمي البسيط والمحدد والحساس والقوي لمحول الإشارة المفسفرة الداخلي ومنشط النسخ (STAT) 1/3/4/5/6 البروتينات في محللات الخلايا بتنسيق 384 بئرا.
Abstract
يلعب محول الإشارة Janus kinase (JAK) / منشط مسار إشارات النسخ (STAT) دورا حاسما في التوسط في الاستجابات الخلوية للسيتوكينات وعوامل النمو. يتم تنشيط بروتينات STAT عن طريق فسفرة التيروزين بوساطة JAKs بشكل رئيسي. التنشيط غير الطبيعي لمسارات إشارات STAT متورط في العديد من الأمراض البشرية ، وخاصة السرطان والحالات المرتبطة بالمناعة. لذلك ، فإن القدرة على مراقبة فسفرة بروتين STAT داخل بيئة إشارات الخلايا الأصلية مهمة لكل من الأبحاث الأكاديمية واكتشاف الأدوية. تشمل تنسيقات الفحص التقليدية المتاحة لقياس بروتينات STAT المفسفرة النشاف الغربي ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). هذه الطرق غير المتجانسة كثيفة العمالة ، ومنخفضة الإنتاجية ، وغالبا ما تكون غير موثوقة (محددة) في حالة النشاف الغربي. تتوفر طرق متجانسة (بدون غسل) ولكنها تظل باهظة الثمن.
هنا ، يتم توفير بروتوكولات مفصلة للقياس الحساس والقوي والفعال من حيث التكلفة في تنسيق 384 بئرا للمستويات الداخلية من STAT1 المفسفرة (Y701) و STAT3 (Y705) و STAT4 (Y693) و STAT5 (Y694 / Y699) و STAT6 (Y641) في محللات الخلايا من الخلايا الملتصقة أو المعلقة باستخدام منصة نقل طاقة الرنين Förster الجديدة التي تم حلها بمرور الوقت (TR-FRET). سير العمل للفحص الخلوي بسيط وسريع ومصمم للفحص عالي الإنتاجية (HTS). بروتوكول الفحص مرن ، ويستخدم عينة منخفضة الحجم (15 ميكرولتر) ، ويتطلب خطوة واحدة فقط لإضافة الكاشف ، ويمكن تكييفه مع التطبيقات منخفضة الإنتاجية وعالية الإنتاجية. يتم التحقق من صحة كل اختبار مناعي لساندويتش فوسفو-ستات في ظل ظروف محسنة مع ناهضات ومثبطات معروفة ويولد قيم علم الأدوية وعامل Z المتوقعة. نظرا لأن اختبارات TR-FRET هي نسبة قياسية ولا تتطلب خطوات غسيل ، فإنها توفر قابلية تكرار أفضل بكثير من الأساليب التقليدية. توفر هذه المجموعة من الفحوصات معا أدوات جديدة فعالة من حيث التكلفة لإجراء تحليل أكثر شمولا لبروتينات STAT المفسفرة المحددة بعد معالجة الخلايا وفحص وتوصيف المعدلات المحددة والانتقائية لمسار إشارات JAK / STAT.
Introduction
يلعب مسار إشارات JAK/STAT دورا رئيسيا في التوسط في الاستجابات الخلوية للسيتوكينات المتنوعة والإنترفيرون وعوامل النمو والجزيئات ذات الصلة1,2. يؤدي ربط هذه الروابط بمستقبلات سطح الخلية المحددة إلى تنشيط JAKs ، والتي بدورها تنشط بروتينات STAT عن طريق الفسفرة لبقايا التيروزين المحددة. ينتج عن الفسفرة STAT تعريضها ونقلها إلى النواة ، حيث تمارس تأثيرها على نسخ الجينات المستهدفة المنظمة. تتكون عائلة STAT من سبعة أعضاء: STAT1 و STAT2 و STAT3 و STAT4 و STAT5a و STAT5b و STAT6. يلعب الأعضاء دورا معقدا وأساسيا في تنظيم عمليات الخلايا الفسيولوجية ، بما في ذلك الانتشار والتمايز وموت الخلايا المبرمج وتكوين الأوعية الدموية وتنظيم الجهاز المناعي. التنشيط غير الطبيعي لمسارات إشارات STAT متورط في العديد من الأمراض البشرية ، وخاصة السرطان والحالات المتعلقة بالمناعة3,4. لذلك ، فإن القدرة على تقييم فسفرة بروتين STAT داخل بيئة إشارات الخلايا الأصلية مهمة لكل من الأبحاث الأكاديمية واكتشاف الأدوية.
حتى الآن ، فإن الطرق التقليدية المستخدمة لقياس مستويات البروتين المفسفرة داخل الخلايا ، بما في ذلك STATs ، تعتمد على الأجسام المضادة وتشمل النشاف الغربي ، ELISA ، وقياس التدفق الخلوي الفوسفولي. هذه الطرق غير المتجانسة كثيفة العمالة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وعرضة للخطأ ، وإنتاجية منخفضة ، وغالبا ما تكون غير موثوقة (على سبيل المثال ، قضايا الخصوصية) في حالة النشاف الغربي5. وعلى النقيض من ذلك، تتطلب الفحوصات المتجانسة خطوات تجريبية أقل، وتستخدم كميات عينات أصغر، وتكون قابلة لهيئة تحرير الشام. هناك خمس منصات متجانسة للمقايسة المناعية القائمة على الخلايا متاحة تجاريا يمكن استخدامها لمراقبة الفسفرة المعتمدة على JAK من STATs في الليزات الخلوية: SureFire و HTRF و LANCE و LanthaScreen و Lumit. كل من هذه المنصات لها مزاياها وعيوبها.
يعتمد SureFire على تقنية توجيه الأكسجين المضيئة ، والتي تستخدم الخرز المانح والمتقبل المطلي لالتقاط زوج من الأجسام المضادة على وجه التحديد ، أحدها بيوتينيل. في وجود البروتين المفسفر، يجلب الجسمان المضادان حبات المتبرع والمتقبل إلى مكان قريب، مما يتيح توليد إشارة كيميائية مضيئة6. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا متعددة الاستخدامات وحساسة ، إلا أنها باهظة الثمن ، وتتأثر بالبيوتين في وسط الثقافة ، وهي حساسة للغاية لدرجة الحرارة المحيطة والضوء ، وتتطلب قارئا خاصا للكشف. يعتمد كل من HTRF و LANCE على تقنية TR-FRET التي تستخدم مجمعات أيون اللانثانيد المضيئة طويلة العمر (مخلبات اليوروبيوم أو التربيوم ، أو تشفير اليوروبيوم) كجزيئات مانحة والفلوروفورات الحمراء البعيدة كجزيئات متقبلة 7. عندما يتم جلب اثنين من الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين الموسومة إما بجزيئات مانحة أو متقبلة إلى مكان قريب ، يحدث FRET ، مما يتسبب في زيادة في تألق المتقبل وانخفاض في تألق المانحين. يمكن قياس إشارات الفلورسنت طويلة العمر هذه بطريقة يتم حلها زمنيا ونسبة مئوية لتقليل تداخل الفحص وزيادة جودة البيانات. المزايا الأخرى ل TR-FRET هي أنها ليست حساسة للضوء ، وتسمح بالقراءات المتكررة ، وتظهر ثبات إشارة طويل. في حين يتم تنفيذ TR-FRET على نطاق واسع في هيئة تحرير الشام بسبب تنوعها وحساسيتها ومتانتها العالية ، فإن جميع منصات الفحص التجارية القائمة على TR-FRET باهظة الثمن ، مما يحول دون اعتمادها على نطاق واسع في المختبرات الأكاديمية والصناعية الصغيرة. يستخدم فحص LanthaScreen أيضا قراءة قائمة على TR-FRET ولكنه يعتمد على خط خلية U2OS هندسي يعبر بثبات عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)-STAT1 الاندماجي جنبا إلى جنب مع الجسم المضاد STAT1 الخاص بالفوسفو المسمى بالتربيوم8. بالإضافة إلى كونها محدودة من حيث اختيار بروتينات الإشارة ، تتطلب هذه الطريقة شراء خطوط الخلايا المنقولة باهظة الثمن ، مما يقلل من قابليتها للتطبيق ويزيد من إمكانية القطع الأثرية التجريبية. Lumit عبارة عن منصة مقايسة مناعية عامة للإضاءة الحيوية تستخدم الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للفأر والمضادة للأرانب) المصنفة كيميائيا مع الوحدات الفرعية NanoBit الصغيرة والكبيرة من NanoLuc Luciferase9. إن ربط اثنين من الأجسام المضادة الأولية بالبروتين المستهدف يجعل الأجسام المضادة الثانوية قريبة لتشكيل إنزيم نشط يولد إشارة تلألؤ. في حين أن التلألؤ هو عموما قراءة حساسة وقوية ، فإن متطلبات الأجسام المضادة الأولية التي يتم تربيتها في نوعين مختلفين تحد من خيارات تصميم الفحص. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون استخدام الأجسام المضادة الثانوية في مصفوفات العينات المعقدة عرضة لتداخل المقايسة.
وبالتالي ، لا تزال هناك حاجة إلى منصة فحص موثوقة وسريعة وبأسعار معقولة تعتمد على الخلايا لقياس البروتينات الفردية المفسفرة والكلية STAT بطريقة متوافقة مع HTS. ولتلبية هذه الحاجة، تم تطوير منصة جديدة للمقايسة المناعية القائمة على الخلايا عالية الإنتاجية استنادا إلى تقنية TR-FRET المحسنة (THUNDER) والمصممة لتمكين قياس بسيط وحساس وقوي وفعال من حيث التكلفة للبروتينات داخل الخلايا المعبر عنها داخليا (المفسفرة أو الكلية) في الليزات الخلوية. تنبع مزايا هذه التقنية من الجمع بين زوج FRET المانح / المتقبل الذي يظهر توافقا طيفيا استثنائيا وإشارة TR-FRET ، والأجسام المضادة التي تم التحقق منها بدقة ، والمخازن المؤقتة المحسنة للتحليل. يتم تنسيق هذه الفحوصات كمقايسات مناعية للساندويتش وتستخدم سير عمل مباشر من ثلاث خطوات (الشكل 1). يتم التعامل مع الخلايا أولا لتعديل فسفرة البروتين ثم يتم تحليلها باستخدام مخزن التحلل العازل المحدد المقدم في المجموعة. يتم الكشف عن البروتين المستهدف المفسفرة أو بروتين STAT الكلي في الخلية المحللة في خطوة واحدة لإضافة كاشف وحضانة مع زوج من الأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلوروفور التي تتعرف على ظواهر مميزة على البروتين المستهدف (الشكل 2). يتم تصنيف أحد الأجسام المضادة مع متبرع مخلب اليوروبيوم (Eu-Ab1) ، في حين يتم تصنيف الجسم المضاد الثاني مع فلوروفور متقبل أحمر بعيد (FR-Ab2). يرتبط الجسمان المضادان الموسومان بالبروتين الموجود في المحلول ، مما يجعل الملصقين قريبين من بعضهما البعض. يؤدي إثارة مخلب اليوروبيوم المتبرع عند 320 أو 340 نانومتر إلى تشغيل FRET إلى المتقبل ، والذي ينبعث منه إشارة TR-FRET طويلة العمر عند 665 نانومتر تتناسب مع تركيز البروتين المستهدف (المفسفرة أو الإجمالية) في محللات الخلية.
الشكل 1: سير عمل فحص TR-FRET. يتكون سير العمل من ثلاث خطوات: معالجة الخلايا ، وتحلل الخلايا ، واكتشاف البروتين باستخدام TR-FRET. في بروتوكول الفحص المكون من صفيحتين ، يتم نقل الليزات إلى لوحة كشف بيضاء من 384 بئرا ، بينما في بروتوكول اللوحة الواحدة ، يتم إجراء جميع الخطوات في نفس لوحة الكشف البيضاء 384 بئرا (بروتوكول الكل في البئر الواحد). بغض النظر عن بروتوكول الفحص المستخدم ، يتم إجراء الكشف عن البروتين بنفس الحجم الكلي (20 ميكرولتر لكل بئر). اختصار: TR-FRET = نقل طاقة الرنين Förster الذي تم حله بمرور الوقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مبدأ المقايسة المناعية لساندويتش TR-FRET. يتم تسمية أحد الأجسام المضادة بمتبرع مخلب اليوروبيوم (Eu-Ab1) والثاني مع متقبل الفلوروفور الصغير الأحمر (FR-Ab2). يرتبط الجسمان المضادان المصنفان على وجه التحديد بظواهر مميزة على البروتين المستهدف (المفسفرة أو الكلية) في محللات الخلية ، مما يجعل اثنين من الفلوروفورات في مكان قريب. إثارة مخلب يوروبيوم المتبرع عند 320 أو 340 نانومتر يؤدي إلى FRET من المتبرع إلى جزيئات المستقبل ، والتي بدورها تنبعث منها إشارة عند 665 نانومتر. هذه الإشارة تتناسب مع تركيز البروتين في الخلية lysate. في حالة عدم وجود البروتين المستهدف المحدد ، تكون الفلوروفورات المانحة والمتقبلة بعيدة جدا عن بعضها البعض بحيث لا يمكن أن تحدث FRET. الاختصارات: FRET = نقل طاقة الرنين Förster; TR-FRET = FRET الذي تم حله بمرور الوقت ؛ Ab = الأجسام المضادة; FR = أحمر بعيد; Eu – مخلب اليوروبيوم. P = الفسفرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هنا ، يتم توفير بروتوكولات مفصلة لقياس ، بتنسيق 384 بئرا ، المستويات داخل الخلايا من STAT1 (Y701) ، STAT3 (Y705) ، STAT4 (Y693) ، STAT5 (Y694 / Y699) ، و STAT6 (Y641) ، جنبا إلى جنب مع إجمالي STAT1 و STAT3 و STAT5 و STAT6 ، في محللات الخلايا من الخلايا الملتصقة أو المعلقة باستخدام منصة THUNDER TR-FRET. تحدد هذه البروتوكولات خطوات لمعالجة الخلايا والتحلل والكشف عن البروتين المستهدف القائم على TR-FRET باستخدام بروتوكول نقل من صفيحتين أو بروتوكول بئر الكل في واحد من صفيحة واحدة. يتم تطبيق هذه الفحوصات القائمة على الخلايا لتحديد الملف الدوائي للمنشطات والمثبطات المعروفة لمسار JAK / STAT. يتم إثبات متانة وملاءمة الفحوصات المختارة لهيئة تحرير الشام. أخيرا ، تتم مناقشة التجارب الرئيسية لتحسين المقايسة ، إلى جانب توصيات لاستكشاف أخطاء الفحص وإصلاحها.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالمقارنة مع الطرق التقليدية لتحليل البروتين الفوسفوبروتيني مثل النشاف الغربي والطرق القائمة على ELISA ، فإن سير العمل الخاص بالفحص الخلوي THUNDER TR-FRET بسيط وسريع ، ويستخدم عينة منخفضة الحجم (15 ميكرولتر) ، وهو مصمم ل HTS بتنسيق 384 بئر ، وهو قابل للغاية للأتمتة. بروتوكول الفحص مرن ويمكن تكييفه بسهو…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile | Corning | 3595 | This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used |
| 384-well microplate, white, low-volume | PerkinElmer | 6007290 | This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used |
| A431 cell line | ATCC | CRL-1555 | |
| Adhesive microplate seal | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| EnVision Xcite Multilabel plate reader | PerkinElmer | 2104-0020A | The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option |
| Erlotinib hydrochloride | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon tissue culture treated flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibitor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Orbital plate shaker | Many options available | Not applicable | |
| Recombinant human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant human IFNα2b | ProSpec | CYT-460 | |
| Recombinant human IL-4 | R&D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT4PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 cell line | ATCC | TIB-196 | |
| Ultrapure water | NA | NA | Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer |
Riferimenti
- Villarino, A., Kanno, Y., O’Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
- O’Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
- Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
- Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).
- Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
- Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).
- Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
- Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
- Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
- Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
- Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
- Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029 (2018).
