Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas
Summary
Os protocolos de ensaio baseados em células de ressonância Förster são descritos para a quantificação simples, específica, sensível e robusta do transdutor de sinal endogenso e ativador de transcrição (STAT) 1/3/4/5/6 em lises celulares em um formato de 384 poços.
Abstract
O caminho de sinalização Janus kinase (JAK)/sinal e ativador da via de sinalização de transcrição (STAT) desempenha um papel crucial na mediação de respostas celulares às citocinas e fatores de crescimento. As proteínas STAT são ativadas por fosforilação de tirasina mediada principalmente por JAKs. A ativação anormal das vias de sinalização STAT está implicada em muitas doenças humanas, especialmente câncer e condições imunológicas. Portanto, a capacidade de monitorar a fosforilação da proteína STAT dentro do ambiente de sinalização celular nativa é importante tanto para a pesquisa acadêmica quanto para a descoberta de drogas. Os formatos tradicionais de ensaio disponíveis para quantificar proteínas STAT fosforiladas incluem manchas ocidentais e o ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). Estes métodos heterogêneos são intensivos em mão-de-obra, de baixa produtividade e, muitas vezes, não são confiáveis (específicos) no caso da mancha ocidental. Métodos homogêneos (sem lavagem) estão disponíveis, mas permanecem caros.
Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para os sensíveis, robustos, e medição econômica em um formato 384-well de níveis endógenos de STAT1 fosforilato (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641) em células de células aderentes ou suspensas usando a nova plataforma de transferência de energia de ressonância Förster (TR-FRET) resolvida pelo tempo THUNDER. O fluxo de trabalho para o ensaio celular é simples, rápido e projetado para triagem de alto rendimento (HTS). O protocolo de ensaio é flexível, usa uma amostra de baixo volume (15 μL), requer apenas uma etapa de adição de reagentes e pode ser adaptado a aplicações de baixo rendimento e alto rendimento. Cada imunoensaio sanduíche phospho-STAT é validado em condições otimizadas com agonistas e inibidores conhecidos e gera os valores esperados de farmacologia e fator Z’-factor. Como os ensaios TR-FRET são ratiométricos e não requerem etapas de lavagem, eles fornecem uma reprodutibilidade muito melhor do que as abordagens tradicionais. Juntos, este conjunto de ensaios fornece novas ferramentas econômicas para uma análise mais abrangente das proteínas STAT fosfoiladas específicas após o tratamento celular e a triagem e caracterização de moduladores específicos e seletivos da via de sinalização JAK/STAT.
Introduction
A via de sinalização JAK/STAT desempenha um papel fundamental na mediação de respostas celulares a diversas citocinas, interferons, fatores de crescimento e moléculas relacionadas1,2. A ligação desses ligantes a receptores específicos de superfície celular resulta na ativação de JAKs, que por sua vez ativam proteínas STAT por fosforilação de resíduos específicos de tyrosina. A fosforilação STAT resulta em sua dimerização e translocação para o núcleo, onde exercem seu efeito sobre a transcrição de genes-alvo regulados. A família STAT é composta por sete membros: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b e STAT6. Os membros desempenham um papel complexo e essencial na regulação dos processos fisiológicos das células, incluindo proliferação, diferenciação, apoptose, angiogênese e regulação do sistema imunológico. A ativação anormal das vias de sinalização STAT está implicada em muitas doenças humanas, especialmente câncer e condições imunológicas3,4. Portanto, a capacidade de avaliar a fosforilação da proteína STAT dentro do ambiente de sinalização celular nativa é importante tanto para pesquisas acadêmicas quanto de descoberta de drogas.
Até o momento, os métodos convencionais utilizados para medir os níveis de proteína fosfoilada intracelular, incluindo OST, são à base de anticorpos e incluem mancha ocidental, ELISA e citometria fosfoflua. Esses métodos heterogêneos são intensivos em mão-de-obra, demorados, propensos a erros, baixo rendimento e, muitas vezes, não confiáveis (por exemplo, questões de especificidade) no caso de manchas ocidentais5. Em contraste, ensaios homogêneos requerem menos etapas experimentais, usam volumes amostrais menores e são favoráveis ao HTS. Existem cinco plataformas homogêneas de imunoensaio baseadas em células disponíveis comercialmente que podem ser usadas para monitorar quantitativamente a fosforilação dependente de STATs em lises celulares: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen e Lumit. Cada uma dessas plataformas tem suas vantagens e desvantagens.
SureFire é baseado na tecnologia luminescente de canalização de oxigênio, que utiliza contas de doadores e aceitadores revestidas para capturar especificamente um par de anticorpos, um dos quais é biotinilado. Na presença de proteína fosfoilada, os dois anticorpos aproximam o doador e o aceitador, permitindo a geração de um sinal quimiomanuminescente6. Embora versátil e sensível, essa tecnologia é cara, é afetada pela biotina no meio da cultura, é muito sensível à temperatura ambiente e à luz, e requer um leitor especial para detecção. HTRF e LANCE são ambos baseados na tecnologia TR-FRET que utiliza complexos de íons de ion de lantano luminescente de longa duração (europium ou terbium chelates, ou criptoato europium) como as moléculas doadoras e fluoroforos distantes como as moléculas aceitadoras7. Quando dois anticorpos específicos de proteína rotulados com moléculas doadoras ou aceitadoras são trazidos para a proximidade, o FRET ocorre, causando um aumento da fluorescência aceitadora e uma diminuição da fluorescência do doador. Esses sinais fluorescentes de longa duração podem ser medidos de forma econômica e racionável para reduzir a interferência de ensaios e aumentar a qualidade dos dados. Outras vantagens do TR-FRET são que ele não é sensível à luz, permite leituras repetidas e exibe estabilidade de sinal longa. Embora o TR-FRET seja amplamente implementado no HTS devido à sua versatilidade, sensibilidade e alta robustez, todas as plataformas comerciais de ensaio baseadas em TR-FRET são caras, impedindo assim sua ampla adoção em laboratórios acadêmicos e pequenos industriais. O ensaio LanthaScreen também usa uma leitura baseada em TR-FRET, mas depende de uma linha celular U2OS projetada que expressa a proteína fluorescente verde (GFP)-STAT1 proteína de fusão combinada com um anticorpo STAT1 phospho-specific phospho-specific. Além de limitado em termos de escolha de proteínas de sinalização, este método requer a compra de linhas celulares transfectadas caras, reduzindo sua aplicabilidade e aumentando a possibilidade de artefatos experimentais. Lumit é uma plataforma genérica de imunoensaio bioluminescente que utiliza anticorpos secundários (anti-rato e anti-coelho) quimicamente rotulados com as pequenas e grandes subunidades NanoBit da NanoLuc Luciferase9. A ligação de dois anticorpos primários à proteína alvo traz os anticorpos secundários à proximidade para formar uma enzima ativa que gera um sinal de luminescência. Embora a luminescência seja geralmente uma leitura sensível e robusta, a exigência de anticorpos primários criados em duas espécies diferentes limita as escolhas para o design do ensaio. Além disso, o uso de anticorpos secundários em matrizes amostrais complexas pode ser propenso a talda interferência.
Assim, ainda existe uma necessidade de uma plataforma de ensaio confiável, rápida, mas acessível baseada em células para medir proteínas STAT fosforiladas individuais e totais de uma maneira compatível com HTS. Para atender a essa necessidade, uma nova plataforma de imunoensaio baseada em células de alto rendimento foi desenvolvida com base em uma tecnologia TR-FRET aprimorada (THUNDER) e projetada para permitir uma medição simples, sensível, robusta e econômica de proteínas intracelulares expressas endógenamente (fosfoiladas ou totais) em lises celulares. As vantagens dessa tecnologia decorrem da combinação de um par FRET doador/aceitor exibindo compatibilidade espectral excepcional e sinal TR-FRET, anticorpos rigorosamente validados e buffers de lise otimizados. Estes ensaios são formatados como imunoensaio sanduiche e usam um fluxo de trabalho simples de três etapas (Figura 1). As células são primeiro tratadas para modular a fosforilação proteica e, em seguida, lysed com o tampão de lise específico fornecido no kit. A proteína STAT fosforilada ou total no liseto celular é detectada em um único passo de adição e incubação de reagentes com um par de anticorpos rotulados por fluoforo que reconhecem epítopos distintos na proteína alvo (Figura 2). Um anticorpo é rotulado com um doador de quelato europium (Eu-Ab1), enquanto o segundo anticorpo é rotulado com um fluoróforo aceitador vermelho distante (FR-Ab2). Os dois anticorpos rotulados se ligam à proteína em solução, aproximando os dois rótulos. A excitação do doador Europium chelate a 320 ou 340 nm desencadeia um FRET para o aceitador, que emite um sinal TR-FRET de longa duração a 665 nm proporcional à concentração de proteína-alvo (fosfoilada ou total) no lysato celular.
Figura 1: Fluxo de trabalho de ensaio TR-FRET. O fluxo de trabalho consiste em três etapas: tratamento celular, lise celular e detecção de proteínas utilizando TR-FRET. No protocolo de ensaio de duas placas, os lysates são transferidos para uma placa de detecção branca de 384 poços, enquanto no protocolo de uma placa, todas as etapas são conduzidas na mesma placa branca de detecção de 384 poços (protocolo tudo em um poço). Independentemente do protocolo de ensaio utilizado, a detecção de proteínas é realizada no mesmo volume total (20 μL por poço). Abreviação: TR-FRET = transferência de energia de ressonância Förster resolvida pelo tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Princípio de imunoensaio do sanduíche TR-FRET. Um anticorpo é rotulado com o doador de quelato europium (Eu-Ab1) e o segundo com o pequeno aceitador de fluoreóforo (FR-Ab2). Os dois anticorpos rotulados se ligam especificamente a epítopos distintos na proteína alvo (fosforilado ou total) no lysato celular, aproximando os dois fluoroforos. A excitação do doador Europium chelate a 320 ou 340 nm desencadeia um FRET do doador para as moléculas aceitadoras, que por sua vez emitem um sinal a 665 nm. Este sinal é proporcional à concentração de proteína no lisecelular. Na ausência da proteína alvo específica, os fluoroforos doadores e aceitantes estão muito distantes um do outro para que o FRET ocorra. Abreviaturas: FRET = Transferência de energia de ressonância förster; TR-FRET = FRET resolvido pelo tempo; Ab = anticorpo; FR = vermelho distante; Eu – Europium chelate; P = fosforilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para medir, em formato 384-well, os níveis intracelulares de STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641), juntamente com STAT1 total, STAT3, STAT5 e STAT6, em células de células aderentes ou suspensas usando a plataforma THUNDER TR-FRET. Esses protocolos definem etapas para tratamento celular, lise e detecção de proteína de alvo baseada em TR-FRET usando um protocolo de transferência de duas placas ou um protocolo all-in-one-well. Esses ensaios baseados em células são aplicados para determinar o perfil farmacológico de ativadores e inibidores conhecidos da via JAK/STAT. A robustez e adequação dos ensaios selecionados para HTS são demonstradas. Por fim, são discutidos experimentos-chave para otimização de ensaios, juntamente com recomendações para a solução de problemas de ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparado aos métodos convencionais para análise de fosfoproteína, como a mancha ocidental e os métodos baseados em ELISA, o fluxo de trabalho para um ensaio celular THUNDER TR-FRET é simples e rápido, usa uma amostra de baixo volume (15 μL), é projetado para HTS em um formato de 384 poços, e é altamente favorável à automação. O protocolo de ensaio é flexível e pode ser facilmente adaptado a aplicações de médio e alto rendimento. Os ensaios podem ser executados usando um protocolo de transferência de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| 96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile | Corning | 3595 | This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used |
| 384-well microplate, white, low-volume | PerkinElmer | 6007290 | This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used |
| A431 cell line | ATCC | CRL-1555 | |
| Adhesive microplate seal | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| EnVision Xcite Multilabel plate reader | PerkinElmer | 2104-0020A | The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option |
| Erlotinib hydrochloride | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon tissue culture treated flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibitor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Orbital plate shaker | Many options available | Not applicable | |
| Recombinant human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant human IFNα2b | ProSpec | CYT-460 | |
| Recombinant human IL-4 | R&D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT4PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 cell line | ATCC | TIB-196 | |
| Ultrapure water | NA | NA | Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer |
Riferimenti
- Villarino, A., Kanno, Y., O’Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
- O’Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
- Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
- Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).
- Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
- Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).
- Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
- Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
- Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
- Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
- Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
- Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029 (2018).
