Ensayos de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo para la medición de proteínas STAT fosforiladas endógenas en células humanas
Summary
Los protocolos de ensayo basados en células de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo se describen para la cuantificación simple, específica, sensible y robusta del transductor de señal fosforilada endógena y el activador de la transcripción (STAT) 1/3/4/5/6 proteínas en lisados celulares en un formato de 384 pocillos.
Abstract
La vía de señalización de la quinasa Janus (JAK)/transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) desempeña un papel crucial en la mediación de las respuestas celulares a las citoquinas y los factores de crecimiento. Las proteínas STAT son activadas por fosforilación de tirosina mediada principalmente por JAK. La activación anormal de las vías de señalización STAT está implicada en muchas enfermedades humanas, especialmente el cáncer y las afecciones relacionadas con el sistema inmunológico. Por lo tanto, la capacidad de monitorear la fosforilación de la proteína STAT dentro del entorno de señalización celular nativa es importante tanto para la investigación académica como para la investigación de descubrimiento de fármacos. Los formatos de ensayo tradicionales disponibles para cuantificar las proteínas STAT fosforiladas incluyen western blotting y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Estos métodos heterogéneos son intensivos en mano de obra, de bajo rendimiento y, a menudo, no confiables (específicos) en el caso de Western Blotting. Los métodos homogéneos (sin lavado) están disponibles, pero siguen siendo caros.
Aquí, se proporcionan protocolos detallados para la medición sensible, robusta y rentable en un formato de 384 pocillos de niveles endógenos de STAT1 fosforilado (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) y STAT6 (Y641) en lisados celulares de células adherentes o de suspensión utilizando la nueva plataforma de transferencia de energía de resonancia de Förster resuelta en el tiempo (TR-FRET) THUNDER. El flujo de trabajo para el ensayo celular es simple, rápido y está diseñado para el cribado de alto rendimiento (HTS). El protocolo de ensayo es flexible, utiliza una muestra de bajo volumen (15 μL), requiere solo un paso de adición de reactivos y se puede adaptar a aplicaciones de bajo rendimiento y alto rendimiento. Cada inmunoensayo sándwich fosfo-STAT se valida en condiciones optimizadas con agonistas e inhibidores conocidos y genera los valores esperados de farmacología y factor Z’. Como los ensayos TR-FRET son ratiométricos y no requieren pasos de lavado, proporcionan una reproducibilidad mucho mejor que los enfoques tradicionales. Juntos, este conjunto de ensayos proporciona nuevas herramientas rentables para un análisis más completo de proteínas STAT fosforiladas específicas después del tratamiento celular y la detección y caracterización de moduladores específicos y selectivos de la vía de señalización JAK / STAT.
Introduction
La vía de señalización JAK/STAT juega un papel clave en la mediación de las respuestas celulares a diversas citoquinas, interferones, factores de crecimiento y moléculas relacionadas1,2. La unión de estos ligandos a receptores específicos de la superficie celular da como resultado la activación de los JAK, que a su vez activan las proteínas STAT por fosforilación de residuos específicos de tirosina. La fosforilación STAT da como resultado su dimerización y translocación en el núcleo, donde ejercen su efecto sobre la transcripción de genes diana regulados. La familia STAT consta de siete miembros: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b y STAT6. Los miembros desempeñan un papel complejo y esencial en la regulación de los procesos celulares fisiológicos, incluida la proliferación, la diferenciación, la apoptosis, la angiogénesis y la regulación del sistema inmunológico. La activación anormal de las vías de señalización STAT está implicada en muchas enfermedades humanas, especialmente el cáncer y las afecciones relacionadas con el sistema inmunológico3,4. Por lo tanto, la capacidad de evaluar la fosforilación de la proteína STAT dentro del entorno de señalización celular nativa es importante tanto para la investigación académica como para la investigación de descubrimiento de fármacos.
Hasta la fecha, los métodos convencionales utilizados para medir los niveles de proteínas fosforiladas intracelulares, incluidos los STAT, se basan en anticuerpos e incluyen western blotting, ELISA y citometría de flujo de fósforo. Estos métodos heterogéneos requieren mucha mano de obra, consumen mucho tiempo, son propensos a errores, de bajo rendimiento y, a menudo, poco confiables (por ejemplo, problemas de especificidad) en el caso de Western Blotting5. Por el contrario, los ensayos homogéneos requieren menos pasos experimentales, utilizan volúmenes de muestra más pequeños y son susceptibles a HTS. Hay cinco plataformas homogéneas de inmunoensayo basadas en células disponibles comercialmente que se pueden usar para monitorear cuantitativamente la fosforilación dependiente de JAK de STATs en lisados celulares: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen y Lumit. Cada una de estas plataformas tiene sus ventajas y desventajas.
SureFire se basa en la tecnología de canalización de oxígeno luminiscente, que utiliza perlas de donantes y aceptores recubiertas para capturar específicamente un par de anticuerpos, uno de los cuales es biotinilado. En presencia de proteína fosforilada, los dos anticuerpos acercan las perlas donante y aceptora, lo que permite la generación de una señal quimioluminiscente6. Si bien es versátil y sensible, esta tecnología es costosa, se ve afectada por la biotina en el medio de cultivo, es muy sensible a la temperatura ambiente y la luz, y requiere un lector especial para la detección. HTRF y LANCE se basan en la tecnología TR-FRET que utiliza complejos de iones lantánidos luminiscentes de larga duración (quelatos de europio o terbio, o criptoto de europio) como moléculas donantes y fluoróforos de color rojo lejano como moléculas aceptoras7. Cuando dos anticuerpos específicos de proteínas marcados con moléculas donantes o aceptoras se acercan mucho, se produce FRET, causando un aumento en la fluorescencia del aceptor y una disminución en la fluorescencia del donante. Estas señales fluorescentes de larga duración se pueden medir de una manera termal y resuelta en el tiempo para reducir la interferencia del ensayo y aumentar la calidad de los datos. Otras ventajas de TR-FRET son que no es sensible a la luz, permite lecturas repetidas y exhibe una estabilidad de señal larga. Si bien TR-FRET está ampliamente implementado en HTS debido a su versatilidad, sensibilidad y alta robustez, todas las plataformas comerciales de ensayo basadas en TR-FRET son costosas, lo que impide su amplia adopción en laboratorios académicos y pequeños laboratorios industriales. El ensayo LanthaScreen también utiliza una lectura basada en TR-FRET, pero depende de una línea celular U2OS diseñada que expresa de manera estable la proteína de fusión verde fluorescente (GFP)-STAT1 combinada con un anticuerpo STAT1 fosfoespecífico marcado con terbio8. Además de ser limitado en términos de elección de proteínas de señalización, este método requiere la compra de costosas líneas celulares transfectadas, reduciendo su aplicabilidad y aumentando la posibilidad de artefactos experimentales. Lumit es una plataforma genérica de inmunoensayo bioluminiscente que utiliza anticuerpos secundarios (anti-ratón y anti-conejo) marcados químicamente con las subunidades nanobit pequeñas y grandes de NanoLuc Luciferase9. La unión de dos anticuerpos primarios a la proteína diana acerca a los anticuerpos secundarios para formar una enzima activa que genera una señal de luminiscencia. Si bien la luminiscencia es generalmente una lectura sensible y robusta, el requisito de anticuerpos primarios criados en dos especies diferentes limita las opciones para el diseño del ensayo. Además, el uso de anticuerpos secundarios en matrices de muestras complejas puede ser propenso a la interferencia del ensayo.
Por lo tanto, todavía existe la necesidad de una plataforma de ensayo basada en células confiable, rápida pero asequible para medir proteínas STAT fosforiladas y totales individuales de una manera compatible con HTS. Para abordar esta necesidad, se desarrolló una nueva plataforma de inmunoensayo basado en células de alto rendimiento basada en una tecnología TR-FRET mejorada (THUNDER) y diseñada para permitir una medición simple, sensible, robusta y rentable de proteínas intracelulares expresadas endógenamente (fosforiladas o totales) en lisados celulares. Las ventajas de esta tecnología se derivan de la combinación de un par FRET donante/aceptor que exhibe una compatibilidad espectral excepcional y una señal TR-FRET, anticuerpos rigurosamente validados y tampones de lisis optimizados. Estos ensayos se formatean como inmunoensayos sándwich y utilizan un flujo de trabajo sencillo de tres pasos (Figura 1). Las células se tratan primero para modular la fosforilación de proteínas y luego se lisan con el tampón de lisis específico proporcionado en el kit. La proteína STAT fosforilada o total objetivo en el lisado celular se detecta en una sola etapa de adición e incubación de reactivos con un par de anticuerpos marcados con fluoróforos que reconocen epítopos distintos en la proteína objetivo (Figura 2). Un anticuerpo está marcado con un donante de quelato de europio (Eu-Ab1), mientras que el segundo anticuerpo está marcado con un fluoróforo aceptor de color rojo lejano (FR-Ab2). Los dos anticuerpos marcados se unen a la proteína en solución, acercando las dos etiquetas. La excitación del quelato de europio del donante a 320 o 340 nm desencadena un FRET al aceptor, que emite una señal TR-FRET de larga duración a 665 nm proporcional a la concentración de proteína objetivo (fosforilada o total) en el lisado celular.
Figura 1: Flujo de trabajo de ensayo TR-FRET. El flujo de trabajo consta de tres pasos: tratamiento celular, lisis celular y detección de proteínas mediante TR-FRET. En el protocolo de ensayo de dos placas, los lisados se transfieren a una placa de detección blanca de 384 pocillos, mientras que en el protocolo de una placa, todos los pasos se llevan a cabo en la misma placa de detección blanca de 384 pocillos (protocolo todo en un pozo). Independientemente del protocolo de ensayo utilizado, la detección de proteínas se realiza en el mismo volumen total (20 μL por pocillo). Abreviatura: TR-FRET = transferencia de energía de resonancia de Förster resuelta en el tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Principio de inmunoensayo sándwich TR-FRET. Un anticuerpo está marcado con el donante de quelato de europio (Eu-Ab1) y el segundo con el aceptor de fluoróforo pequeño de color rojo lejano (FR-Ab2). Los dos anticuerpos marcados se unen específicamente a epítopos distintos en la proteína objetivo (fosforilada o total) en el lisado celular, acercando los dos fluoróforos. La excitación del quelato de europio del donante a 320 o 340 nm desencadena un FRET del donante a las moléculas aceptoras, que a su vez emiten una señal a 665 nm. Esta señal es proporcional a la concentración de proteína en el lisado celular. En ausencia de la proteína diana específica, los fluoróforos donante y aceptor están demasiado distantes entre sí para que ocurra FRET. Abreviaturas: FRET = transferencia de energía de resonancia de Förster; TR-FRET = FRET resuelto en el tiempo; Ab = anticuerpo; FR = rojo lejano; Eu – quelato de europio; P = fosforilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aquí, se proporcionan protocolos detallados para medir, en un formato de 384 pocillos, los niveles intracelulares de STAT1 fosforilado (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) y STAT6 (Y641), junto con STAT1, STAT3, STAT5 y STAT6 totales, en lisados celulares de celdas adherentes o de suspensión utilizando la plataforma THUNDER TR-FRET. Estos protocolos definen los pasos para el tratamiento celular, la lisis y la detección de proteínas diana basadas en TR-FRET utilizando un protocolo de transferencia de dos placas o un protocolo todo en un pocillo de una placa. Estos ensayos basados en células se aplican para determinar el perfil farmacológico de los activadores e inhibidores conocidos de la vía JAK/STAT. Se demuestra la robustez e idoneidad de los ensayos seleccionados para HTS. Por último, se discuten los experimentos clave para la optimización de ensayos, junto con recomendaciones para la solución de problemas de ensayos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparación con los métodos convencionales para el análisis de fosfoproteínas, como el western blotting y los métodos basados en ELISA, el flujo de trabajo para un ensayo celular THUNDER TR-FRET es simple y rápido, utiliza una muestra de bajo volumen (15 μL), está diseñado para HTS en un formato de 384 pocillos y es altamente susceptible de automatización. El protocolo de ensayo es flexible y se puede adaptar fácilmente a aplicaciones de rendimiento medio y alto. Los ensayos se pueden ejecutar utilizando un…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile | Corning | 3595 | This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used |
| 384-well microplate, white, low-volume | PerkinElmer | 6007290 | This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used |
| A431 cell line | ATCC | CRL-1555 | |
| Adhesive microplate seal | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| EnVision Xcite Multilabel plate reader | PerkinElmer | 2104-0020A | The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option |
| Erlotinib hydrochloride | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon tissue culture treated flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibitor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Orbital plate shaker | Many options available | Not applicable | |
| Recombinant human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant human IFNα2b | ProSpec | CYT-460 | |
| Recombinant human IL-4 | R&D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT4PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 cell line | ATCC | TIB-196 | |
| Ultrapure water | NA | NA | Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer |
Riferimenti
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