בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים
Summary
פרוטוקולי בדיקה מבוססי תאים מבוססי-בסיס של Förster, שנפתרו בזמן, מתוארים עבור הכימות הפשוט, הספציפי, הרגיש והחזק של מתמר אותות זרחן אנדוגני ומפעיל של תמלול (STAT) 1/3/4/5/6 חלבונים בתאים ליסטים בפורמט של 384 בארות.
Abstract
מתמר האיתות יאנוס קינאז (JAK)/אותות ומפעיל מסלול איתות שעתוק (STAT) ממלא תפקיד מכריע בתיווך תגובות סלולריות לציטוקינים וגורמי גדילה. חלבונים STAT מופעלים על ידי טירוזין זרחן בתיווך בעיקר על ידי JAKs. ההפעלה החריגה של מסלולי איתות STAT מעורבת במחלות אנושיות רבות, במיוחד סרטן ותנאים הקשורים למערכת החיסון. לכן, היכולת לעקוב אחר זרחן חלבון STAT בתוך סביבת איתות התא המקומי חשובה הן למחקר אקדמי והן למחקר גילוי תרופות. פורמטי הבדיקה המסורתיים הזמינים לכימות חלבונים סטטיסטיים זרחניים כוללים סופג מערבי ובדיקת החיסון המקושרת לאנזימים (ELISA). שיטות הטרוגניות אלה הן עתירות עבודה, תפוקה נמוכה, ולעתים קרובות לא אמינות (ספציפיות) במקרה של סופג מערבי. שיטות הומוגניות (ללא כביסה) זמינות אך נשארות יקרות.
כאן, פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור המדידה הרגישה, החזקה והחסכונית בפורמט של 384 באר של רמות אנדוגניות של STAT1 זרחן (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) ו- STAT6 (Y641) בתאי ליסטאטים מתאי חסיד או השעיה באמצעות פלטפורמת העברת האנרגיה התהודה החדשה של Förster (TR-FRET). זרימת העבודה עבור הבדיקה הסלולרית היא פשוטה, מהירה ומיועדת להקרנה בתפוקה גבוהה (HTS). פרוטוקול הבדיקה גמיש, משתמש במדגם בנפח נמוך (15 μL), דורש רק שלב אחד של תוספת ריאגנט, וניתן להתאים אותו ליישומים בעלי תפוקה נמוכה ותפוקה גבוהה. כל אימונואסאי כריך phospho-STAT מאומת בתנאים אופטימליים עם אגוניסטים ומעכבים ידועים ומייצר את הפרמקולוגיה הצפויה וערכי Z’factor. מכיוון שבדיקות TR-FRET הן יחסיות ואינן דורשות צעדי כביסה, הן מספקות רבייה טובה בהרבה מגישות מסורתיות. יחד, חבילת בדיקות זו מספקת כלים חסכוניים חדשים לניתוח מקיף יותר של חלבוני STAT זרחניים ספציפיים לאחר טיפול בתאים והסינון ואפיון של אפננים ספציפיים וסלקטיביים של מסלול האיתות JAK / STAT.
Introduction
מסלול האיתות JAK/STAT ממלא תפקיד מרכזי בתיווך תגובות תאיות לציטוקינים מגוונים, אינטרפרונים, גורמי גדילה ומולקולות קשורות1,2. הכריכה של ליגנדים אלה לקולטנים ספציפיים של פני התא גורמת להפעלה של JAKs, אשר בתורו להפעיל חלבונים STAT על ידי זרחן של שאריות טירוזין ספציפיות. זרחן STAT גורם לדימריזציה שלהם וטרנסלוקציה לגרעין, שם הם מפעילים את השפעתם על שעתוק של גנים יעד מוסדר. משפחת STAT מורכבת משבעה חברים: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b ו- STAT6. החברים ממלאים תפקיד מורכב וחיוני בוויסות תהליכי התאים הפיזיולוגיים, כולל התפשטות, בידול, אפופטוזיס, אנגיוגנזה ווויסות מערכת החיסון. ההפעלה החריגה של מסלולי איתות STAT מעורבת במחלות אנושיות רבות, במיוחד סרטן ותנאים הקשורים למערכת החיסון3,4. לכן, היכולת להעריך זרחן חלבון STAT בתוך סביבת איתות התאים המקומיים חשובה הן למחקר אקדמי והן למחקר גילוי תרופות.
עד כה, השיטות הקונבנציונליות המשמשות למדידת רמות החלבון הזרחן התאי, כולל STATs, מבוססות נוגדנים וכוללות סופג מערבי, ELISA וציטומטריית זרחן. שיטות הטרוגניות אלה הן עתירות עבודה, גוזלות זמן רב, מועדות לשגיאות, בעלות תפוקה נמוכה ולעתים קרובות אינן אמינות (לדוגמה, בעיות ספציפיות) במקרה של סופג מערבי5. לעומת זאת, בדיקות הומוגניות דורשות פחות צעדים ניסיוניים, משתמשות בנפחי מדגם קטנים יותר, והן מקובלות על HTS. ישנן חמש פלטפורמות אימונואסאי מבוססות תאים הומוגניות הזמינות מסחרית שניתן להשתמש בהן לניטור כמותי של זרחן תלוי JAK של STATs בליסטים של תאים: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen ו- Lumit. לכל אחת מהפלטפורמות הללו יש יתרונות וחסרונות.
SureFire מבוסס על טכנולוגיית תקשור חמצן זוהרת, המשתמשת בחרוזי תורם ומקבל מצופים ללכוד באופן ספציפי זוג נוגדנים, שאחד מהם הוא biotinylated. בנוכחות חלבון זרחן, שני הנוגדנים מביאים את התורם ואת חרוזי הקבלה לקרבה, ומאפשרים יצירת אות chemiluminescent6. למרות שהיא רב-תכליתית ורגישה, טכנולוגיה זו יקרה, מושפעת מהביוטין במדיום התרבותי, רגישה מאוד לטמפרטורת הסביבה ולאור, ודורשת קורא מיוחד לגילוי. HTRF ו- LANCE מבוססים שניהם על טכנולוגיית TR-FRET המשתמשת במתחמי יונים לנתניד זוהרים לכל החיים הארוכים (יורופיום או טרביום כלאטים, או קריפטט יורופיום) כמולקולות התורם ופלואורופורים אדומים בהרבה כמולקולות המקבל7. כאשר שני נוגדנים ספציפיים לחלבון המסומנים במולקולות תורמות או קבליות מובאים לקרבה, FRET מתרחש, מה שגורם לעלייה בפלואורסצנטיות של מקבל וירידה בפלואורסצנטיות התורם. אותות פלואורסצנטיים ארוכי טווח אלה ניתנים למדידה באופן שנפתר בזמן וביחס כדי להפחית את הפרעות הבדיקה ולהגדיל את איכות הנתונים. יתרונות אחרים של TR-FRET הם שהוא אינו רגיש לאור, מאפשר קריאות חוזרות ונשנות ומפגין יציבות איתות ארוכה. בעוד ש- TR-FRET מיושם באופן נרחב ב- HTS בשל הרב-תכליתיות, הרגישות והחוסן הגבוה שלו, כל פלטפורמות הבדיקה המסחריות המבוססות על TR-FRET יקרות, ובכך מונעות את אימוצו הרחב במעבדות אקדמיות ותעשייתיות קטנות. בדיקת LanthaScreen משתמשת גם בקריאה מבוססת TR-FRET אך מסתמכת על קו תאים מהונדס של U2OS המבטא ביציבות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-STAT1 חלבון היתוך בשילוב עם נוגדן STAT1 ספציפי לזרחן טרביום. בנוסף להיותו מוגבל במונחים של בחירה של חלבוני איתות, שיטה זו דורשת רכישת קווי תאים transfected יקר, הפחתת הישימות שלה והגדלת האפשרות של ממצאים ניסיוניים. Lumit היא פלטפורמת אימונואסאי ביו-לומינציה גנרית המשתמשת בנוגדנים משניים (אנטי עכבר ואנטי ארנב) המסומנים כימית עם יחידות המשנה הקטנות והגדולות של NanoBit של NanoLuc Luciferase9. קשירת שני נוגדנים עיקריים לחלבון המטרה מביאה את הנוגדנים המשניים לקרבה ליצירת אנזים פעיל המייצר אות זוהר. בעוד זוהר הוא בדרך כלל קריאה רגישה וחזקה, הדרישה לנוגדנים ראשוניים המועלים בשני מינים שונים מגבילה את האפשרויות לתכנון הבדיקה. בנוסף, השימוש בנוגדנים משניים במטריצות מדגם מורכבות עשוי להיות מועד להפרעות בדיקה.
לפיכך, עדיין קיים צורך בפלטפורמת בדיקה אמינה, מהירה אך משתלמת המבוססת על תאים למדידת חלבונים בודדים זרחניים וסה”כ STAT באופן התואם ל- HTS. כדי לענות על צורך זה, פותחה פלטפורמת אימונואסאי חדשה המבוססת על תפוקה גבוהה המבוססת על טכנולוגיית TR-FRET משופרת (THUNDER) ונועדה לאפשר מדידה פשוטה, רגישה, חזקה וחסכונית של חלבונים תאיים אנדוגניים (זרחניים או סה”כ) בליסטים של תאים. היתרונות של טכנולוגיה זו נובעים משילוב של זוג FRET תורם/מקבל המציג תאימות ספקטרלית יוצאת דופן ואות TR-FRET, נוגדנים מאומתים בקפדנות ומאגרי תמוגה ממוטבים. בדיקות אלה מעוצבות כהודעות חיסוניות של כריך ומשתמשות בזרימת עבודה פשוטה בת שלושה שלבים (איור 1). תאים מטופלים תחילה כדי לווסת זרחן חלבון ולאחר מכן lysed עם מאגר תמוגה ספציפי המסופק בערכה. חלבון הסטטיסטיקה הממוקד או הכולל של ה-STAT בליסט התא מזוהה בשלב חיבור ריאגנט ודלילה יחיד עם זוג נוגדנים בעלי תווית פלואורופורית המזהים אפיטופים ברורים בחלבון היעד (איור 2). נוגדן אחד מסומן עם תורם כלאט יורופיום (Eu-Ab1), ואילו הנוגדן השני מתויג עם פלואורופור מקבל אדום בהרבה (FR-Ab2). שני הנוגדנים המסומנים נקשרים לחלבון בתמיסה, ומביאים את שתי התוויות לקרבה. עירור של התורם Europium chelate ב 320 או 340 ננומטר מפעיל FRET למקובל, אשר פולט אות TR-FRET ארוך טווח ב 665 ננומטר פרופורציונלי לריכוז של חלבון היעד (זרחן או סה”כ) בתא lysate.
איור 1: זרימת עבודה של בדיקת TR-FRET. זרימת העבודה מורכבת משלושה שלבים: טיפול בתאים, תמוגה לתאים וזיהוי חלבונים באמצעות TR-FRET. בפרוטוקול הבדיקה של שתי הצלחות, הליסטים מועברים ללוחית זיהוי לבנה של 384 בארות, בעוד שבפרוטוקול של צלחת אחת, כל השלבים מתנהלים באותה לוחית זיהוי לבנה של 384 באר (פרוטוקול All-in-One-well). ללא קשר לפרוטוקול הבדיקה המשמש, זיהוי חלבונים מתבצע באותו נפח כולל (20 μL לבאר). קיצור: TR-FRET = העברת אנרגיית תהודה של פורסטר שנפתרה בזמן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עיקרון אימונואסאי כריך TR-FRET. נוגדן אחד מסומן עם תורם כלאט יורופיום (Eu-Ab1) והשני עם מקבל הפלואורופור הקטן והאדום בהרבה (FR-Ab2). שני הנוגדנים המסומנים נקשרים במיוחד לאפיטופים מובחנים על חלבון המטרה (זרחן או סה”כ) בליסט התא, מה שמביא את שני הפלורופורים לקרבה. עירור של התורם Europium chelate ב 320 או 340 ננומטר מפעיל FRET מהתורם למולקולות המקבל, אשר בתורו פולטים אות ב 665 ננומטר. אות זה הוא פרופורציונלי לריכוז החלבון בליסט התא. בהיעדר חלבון היעד הספציפי, פלואורופורים התורם והמקבל רחוקים מדי זה מזה מכדי ש-FRET תתרחש. קיצורים: FRET = העברת אנרגיה תהודה Förster; TR-FRET = FRET שנפתר בזמן; Ab = נוגדן; FR = אדום רחוק; האיחוד האירופי – כלאט יורופיום; P = זרחן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כאן, פרוטוקולים מפורטים מסופקים למדידה, בפורמט של 384 בארות, את הרמות התאיות של STAT1 זרחן (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) ו STAT6 (Y641), יחד עם סך הכל STAT1, STAT3, STAT5, ו STAT6, בתא lysates מתאי דבק או השעיה באמצעות פלטפורמת רעם TR-FRET. פרוטוקולים אלה מגדירים שלבים לטיפול בתאים, תמוגה וזיהוי חלבון יעד מבוסס TR-FRET באמצעות פרוטוקול העברה של שתי לוחות או פרוטוקול All-in-one-well של צלחת אחת. בדיקות מבוססות תאים אלה מוחלות לקביעת הפרופיל הפרמקולוגי של מפעילים ומעכבים ידועים של מסלול JAK / STAT. החוסן וההתאמה של בדיקות נבחרות עבור HTS מודגמות. לבסוף, ניסויים מרכזיים עבור אופטימיזציה לבדיקה נדונים, יחד עם המלצות לפתרון בעיות בדיקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהשוואה לשיטות קונבנציונליות לניתוח פוספופרוטאין כגון סופג מערבי ושיטות מבוססות ELISA, זרימת העבודה עבור בדיקת סלולר THUNDER TR-FRET היא פשוטה ומהירה, משתמשת במדגם בנפח נמוך (15 μL), מיועדת ל- HTS בפורמט של 384 בארות, והיא נוחה מאוד לאוטומציה. פרוטוקול הבדיקה גמיש וניתן להתאים אותו בקלות הן ליישומים בעל?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile | Corning | 3595 | This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used |
| 384-well microplate, white, low-volume | PerkinElmer | 6007290 | This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used |
| A431 cell line | ATCC | CRL-1555 | |
| Adhesive microplate seal | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| EnVision Xcite Multilabel plate reader | PerkinElmer | 2104-0020A | The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option |
| Erlotinib hydrochloride | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon tissue culture treated flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibitor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Orbital plate shaker | Many options available | Not applicable | |
| Recombinant human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant human IFNα2b | ProSpec | CYT-460 | |
| Recombinant human IL-4 | R&D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT4PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 cell line | ATCC | TIB-196 | |
| Ultrapure water | NA | NA | Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer |
Riferimenti
- Villarino, A., Kanno, Y., O’Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
- O’Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
- Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
- Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).
- Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
- Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).
- Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
- Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
- Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
- Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
- Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
- Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029 (2018).
