Rating L-DOPA-induceret dyskinesier i den ensidigt 6-OHDA-læsionerede rottemodel af Parkinsons sygdom

Summary

Gnavermodeller af L-DOPA-inducerede dyskinesier er uvurderlige værktøjer til at identificere terapeutiske interventioner for at dæmpe udviklingen eller lindre de manifestationer, der opstår på grund af gentagen administration af L-DOPA. Denne protokol demonstrerer, hvordan man inducerer og analyserer dyskinetisk-lignende bevægelser i den ensidigt 6-OHDA-læsionerede rottemodel af Parkinsons sygdom.

Abstract

L-DOPA-inducerede dyskinesier (LID’er) henviser til motoriske komplikationer, der opstår ved langvarig L-DOPA-administration til patienter med Parkinsons sygdom (PD). Det mest almindelige mønster, der observeres i klinikken, er topdosis dyskinesi, som består af kliniske manifestationer af choreiform, dystoniske og ballistiske bevægelser. 6-hydroxydopamin (6-OHDA) rottemodellen af PD efterligner flere egenskaber ved LID’er. Efter gentagen L-DOPA-administration udviser 6-OHDA-læsionerede rotter dyskinetisk-lignende bevægelser (f.eks. Unormale ufrivillige bevægelser, AIM’er). Denne protokol demonstrerer, hvordan man inducerer og analyserer AIM’er hos 6-OHDA-læsionerede rotter med 90% -95% dopaminerg udtømning i nigrostriatalvejen. Gentagen administration (3 uger) af L-DOPA (5 mg/kg kombineret med 12,5 mg/kg benserazid) kan fremkalde udviklingen af AIM’er. Tidsforløbsanalysen afslører en signifikant stigning i AIM’er efter 30-90 min (topdosis dyskinesi). Gnavermodeller af LID’er er et vigtigt præklinisk værktøj til at identificere effektive antidyskinetiske interventioner.

Introduction

Dopaminprecursoren L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) repræsenterer den mest effektive behandling af de motoriske symptomer på Parkinsons sygdom (PD)¹. L-DOPA-behandling kan forbedre motoriske symptomer forbundet med PD, men mister effektivitet med tiden. Motoriske udsving såsom “afslidningsudsving” eller “dosisafslutningsforringelse” manifesterer sig klinisk som en forkortet varighed af effekten af enkelte L-DOPA-doser². I andre tilfælde består kliniske manifestationer af langsomme vridningsbevægelser og unormale stillinger (dystoni)³ og opstår, når dopaminniveauet er lavt (dystoni uden for perioden)⁴. På den anden side vises L-DOPA-inducerede dyskinesier (LID’er), når dopaminniveauerne i plasmaet og hjernen er høje⁵.

LID’er producerer svækkende bivirkninger, der inkluderer motoriske komplikationer såsom choreiform, dystoniske og ballistiske^6-satser. Når de er etableret, forekommer LID’er efter hver L-DOPA-administration. Motoriske komplikationer forekommer hos 40% -50% af PD-patienter, der gennemgår L-DOPA-behandling i 5 år, og forekomsten stiger over årene⁷. Selvom de patofysiologiske mekanismer, der er involveret i udviklingen af LID’er hos PD-patienter, endnu ikke er fuldt belyst, er omfanget af dopaminerg denervation, pulsatil L-DOPA-administration, nedstrøms ændringer i striatale proteiner og gener og abnormiteter i ikke-dopamintransmittersystemer faktorer, der bidrager til udviklingen af disse uønskede bivirkninger 6,8,9,10.

Neurotoksinet 6-hydroxydopamin (6-OHDA) er et velkarakteriseret værktøj til at studere PD hos gnavere^11,12,13,14. Da 6-OHDA ikke krydser blod-hjerne-barrieren, skal den injiceres direkte i den nigrostriatale vej. 6-OHDA-induceret dopaminerg udtømning er koncentrations- og stedafhængig¹⁵. Ensidig administration af 6-OHDA ved det mediale forhjernebundt (MFB) kan producere alvorlig (>90%) nigrostriatal skade hos gnavere^16,17,18,19. Kronisk administration af L-DOPA til svær ensidigt 6-OHDA-læsionerede gnavere forårsager udseendet af dyskinetisk-lignende bevægelser kaldet unormale ufrivillige bevægelser (AIM’er). Dyskinetisk-lignende bevægelser hos gnavere deler lignende molekylære, funktionelle og farmakologiske mekanismer relateret til LID’er hos PD-patienter⁵. Derfor er 6-OHDA-læsionerede rotter²⁰ og mus²¹ værdifulde prækliniske modeller til undersøgelse af LID’er. Når de behandles kronisk (7-21 dage) med terapeutiske doser af L-DOPA (5-20 mg/kg), viser ensidigt 6-OHDA-læsionerede rotter og mus en gradvis udvikling af AIM’er, der påvirker forbens-, bagagerums- og orofacialmusklerne i modsætning til læsionen 17,18,19,20,22,23,24 . Disse bevægelser præsenteres på et tidsforløb svarende til L-DOPA-induceret topdosis dyskinesier hos PD-patienter²⁵ og er karakteriseret ved hyperkinetiske bevægelser og dystoni⁵. AIM’er scores normalt baseret på deres sværhedsgrad (f.eks. Når et specifikt AIM er til stede) og amplitude (f.eks. Karakteriseret ved amplituden af hver bevægelse)5,23,25.

6-OHDA-læsionerede gnavermodeller af LID’er har ansigtsvaliditet (dvs. modellen har flere egenskaber, der ligner den menneskelige tilstand)5,11,26,27,28. Gnaver AIM’er, svarende til hvad der forekommer hos PD-patienter, ses som hyperkinetiske (forben og orolinguale) og dystoniske (aksiale) bevægelser²⁹ og efterligner dyskinesi med topdosis. På molekylært og funktionelt niveau deler gnavermodeller mange patologiske egenskaber med PD-patienter⁵, såsom opregulering af FosB / ΔFosB 19,26,30,31,32,33 og serotonintransportør (SERT)^34,35 . Med hensyn til prædiktiv validitet har lægemidler, der reducerer LID’er hos PD-patienter (f.eks. N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptorantagonisten amantadin), antidyskinetisk effekt i gnavermodellen 22,36,37,38,39.

Gnaver AIM’s rating skala blev oprettet baseret på fire AIM’er undertyper, der omfatter AIM’er, der påvirker hoved, nakke og bagagerum (aksiale AIM’er), hyperkinetiske forbensbevægelser (lemmer AIM’er) og dyskinetisk-lignende orolinguale bevægelser (orolinguale AIM’er). Selvom kontralateral rotation (lokomotiv-AIM’er) også er til stede i ensidigt læsionerede gnavere 20,22,23,25,40, er det ikke blevet scoret som en dyskinetisk-lignende bevægelse, da den muligvis ikke repræsenterer et specifikt mål for LIDs 22,37,41.

Her vil vi beskrive, hvordan man inducerer og analyserer dyskinetisk-lignende bevægelser (aksiale, lemmer og orolinguale AIM’er) i den svære (>90%) ensidigt 6-OHDA-læsionerede rottemodel af PD. Vi organiserede vores protokol baseret på den tidligere litteratur og vores laboratorieekspertise.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med Den etiske komité for Det Filosofiske, Naturvidenskabelige Fakultet og Breve i Ribeirão Preto (CEUA / FFCLRP 18.5.35.59.5). 1. 6-OHDA læsion Brug Sprague-Dawley hanrotter, der vejer 200-250 g i begyndelsen af forsøgene (6 uger). Opstald dyrene (2-3 pr. bur) under standard laboratorieforhold (12:12 h lys/mørk cyklus, lys tændt kl. 06:00, temperaturstyrede faciliteter (22-24 °C), med mad og vand til rådighe…

Representative Results

Selvom de AIM’er, der observeres hos rotter, er enklere og begrænsede sammenlignet med dem, der observeres hos mennesker og ikke-menneskelige primater, reproducerer denne model både hyperkinetiske og dystonlignende bevægelser induceret af kronisk L-DOPA-administration. Her præsenterer vi data indsamlet fra en gruppe (n = 10) af ensidigt 6-OHDA-læsionerede rotter kronisk behandlet med L-DOPA (5 mg / kg kombineret med 12,5 mg / kg benserazid) i 3 uger (mandag til fredag). Bemærk, at dataene i figur <strong class="xfi…

Discussion

Denne protokol demonstrerer, hvordan man inducerer og analyserer AIM’er i rottemodellen af PD induceret ved ensidig mikroinjektion af 6-OHDA i MFB. Kronisk daglig administration af lave doser af L-DOPA (5 mg/kg kombineret med 12,5 mg/kg benserazid) medførte udvikling af AIM’er i løbet af de 3 ugers behandling. Tidsmæssig analyse afslørede en signifikant stigning i AIM’er, og topdosis dyskinesi observeres mellem 30 og 90 minutter efter L-DOPA-administration. AIM’er er gentagne og formålsløse bevægelser, der påvirk…

Materials

6-hydroxydopamine hydrobromide	Sigma-Aldrich, USA	H6507	Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride	Sigma	B7283	Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B	HIKVISION	DS-2CE16C0T-IRP	Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride	Alfa Aesar	J63723	Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride	Ceva Animal Health		Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)	Cayman Chemical Company	16149	Dopamine precursor
Mirrors			Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm	PrecisionGlide		Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl)	Samtec		Salt
Syringes 1 ml Sterile	BD Plastipak		Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders			Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride	Ceva Animal Health		Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention