تصنيع الموائع الدقيقة للكبسولات الدقيقة Core-Shell التي تحمل كرويات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Summary
توضح هذه المقالة تغليف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام جهاز تركيز التدفق المحوري المشترك. نحن نثبت أن تقنية تغليف الموائع الدقيقة هذه تمكن من التكوين الفعال للكرويات hPSC.
Abstract
توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) أو الكروية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) فوائد تحسين نتائج التمايز وقابلية التوسع. في هذه الورقة ، نصف استراتيجية للتكوين القوي والقابل للتكرار للكرويات hPSC حيث يتم استخدام جهاز تركيز التدفق المحوري المشترك لمحاصرة hPSCs داخل كبسولات microcapsule الأساسية shell. يحتوي الحل الأساسي على تعليق خلية واحدة من hPSCs وتم جعله لزجا من خلال دمج البولي (الإيثيلين جلايكول) عالي الوزن الجزيئي (PEG) ووسائط تدرج الكثافة. يتكون تيار القشرة من PEG-4 arm-maleimide أو PEG-4-Mal ويتدفق جنبا إلى جنب مع التيار الأساسي نحو تقاطعين نفطيين متتاليين. حدث تكوين القطيرات عند تقاطع الزيت الأول مع محلول قذيفة يلتف حول القلب. حدث التشابك الكيميائي للقذيفة عند تقاطع الزيت الثاني عن طريق إدخال رابط متقاطع ثنائي الثيول (1,4-dithiothreitol أو DTT) إلى هذه القطرات. يتفاعل الرابط المتقاطع مع المجموعات الوظيفية الماليميدية عبر كيمياء النقر ، مما يؤدي إلى تكوين قشرة هيدروجيل حول الكبسولات الدقيقة. أنتجت تقنية التغليف الخاصة بنا كبسولات قطرها 400 ميكرومتر بمعدل 10 كبسولات في الثانية. تحتوي الكبسولات الناتجة على قشرة هيدروجيل ونواة مائية سمحت للخلايا المفردة بالتجمع بسرعة في مجاميع وتشكيل كرويات. لم تؤثر عملية التغليف سلبا على صلاحية hPSCs ، حيث لوحظت قابلية >95٪ من الجدوى بعد 3 أيام من التغليف. وللمقارنة، فإن مركبات الكربون الهيدروكلورية المغلفة في جسيمات هلامية صلبة (بدون نواة مائية) لم تشكل كرويات وكان لها قابلية <50٪ قابلة للحياة بعد 3 أيام من التغليف. حدث التكوين الكروي ل hPSCs داخل الكبسولات الدقيقة ذات الغلاف الأساسي في غضون 48 ساعة بعد التغليف ، مع كون القطر الكروي دالة على كثافة تلقيح الخلايا. بشكل عام ، كانت تقنية تغليف الموائع الدقيقة الموصوفة في هذا البروتوكول مناسبة تماما لتغليف hPSCs وتشكيل كروي.
Introduction
هناك اهتمام كبير في الثقافات ثلاثية الأبعاد للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بسبب تحسين تعدد القدرات وإمكانات التمايز التي يوفرها تنسيق الثقافة هذا1،2،3. عادة ما يتم تشكيل hPSCs في كرويات أو تنسيقات أخرى للثقافة ثلاثية الأبعاد عن طريق المفاعلات الحيوية والآبار الدقيقة والمواد الهلامية المائية والسقالات البوليمرية4،5،6. يوفر التغليف وسيلة أخرى لتنظيم hPSCs مفردة في كرويات. بمجرد تغليف الكريات hPSC ، يمكن التعامل معها بسهولة ونقلها إلى لوحات microtiter للتمايز أو نمذجة الأمراض أو تجارب اختبار المخدرات. كما أن تغليف hPSCs في طبقة هيدروجيل يحمي الخلايا من تلف القص ويسمح بزراعة الكرويات في مفاعل حيوي بمعدلات عالية من التحريك7.
تطورت منهجيتنا لتغليف الخلايا الجذعية بمرور الوقت. أولا، ركزنا على الجسيمات الدقيقة الهيدروجيل الصلبة وأظهرنا نجاحا في تغليف وزراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (mESCs)8. ومع ذلك، لوحظ أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لها صلاحية منخفضة عند تغليفها في مثل هذه الجسيمات الدقيقة الهيدروجيلية، ويرجع ذلك على الأرجح إلى زيادة حاجة هذه الخلايا إلى إعادة الاتصال بين الخلايا والخلايا بعد التغليف. لقد استنتجنا أن الكبسولة الدقيقة غير المتجانسة ، التي تمتلك نواة مائية ، قد تكون أكثر ملاءمة لتغليف الخلايا التي تعتمد على إعادة التأسيس السريع لاتصالات الخلايا الخلوية. تم تكييف مفهوم جهاز الموائع الدقيقة الذي يركز على التدفق المحوري المشترك لصنع كبسولات صغيرة من الغلاف المائي الأساسي / الهيدروجيل من He et al.9 ، ولكن بدلا من الجينات المستخدمة في النهج الأصلي ، تم دمج هيدروجيل قائم على PEG في القشرة. لقد أظهرنا لأول مرة التغليف الناجح والتكوين الكروي لخلايا الكبد الأولية في الكبسولات الدقيقة ذات القشرة الأساسية10 ووصفنا مؤخرا تغليف خلايا hES و iPS7. كما هو موضح في الشكل 1A ، يتم تصنيع الكبسولات في جهاز تركيز التدفق حيث تنتقل تيارات التدفق الصدفي والأساسي من جانب إلى آخر إلى التدفق المحوري المشترك قبل الطرد إلى مرحلة الزيت. يحتوي التدفق الأساسي على خلايا وإضافات تزيد من لزوجة المحلول (PEG MW 35kD غير التفاعلي و iodixanol – الاسم التجاري OptiPrep) بينما يحتوي تيار القشرة على جزيئات تفاعلية (PEG-4-Mal). يتم فصل تيار التدفق المحوري المشترك المستمر إلى قطرات تحتفظ ببنية الغلاف الأساسي. يتم جعل بنية الغلاف الأساسي دائمة عن طريق التعرض ل di-thiol crosslinker (DTT) ، والذي يتفاعل مع PEG-4-Mal عبر كيمياء النقر ويؤدي إلى تكوين جلد هيدروجيل رقيق (~ 10 ميكرومتر) أو قذيفة. بعد كسر المستحلب ونقل الكبسولات إلى مرحلة مائية ، تنتشر جزيئات PEG من القلب ويتم استبدالها بجزيئات الماء. هذا يؤدي إلى كبسولات مائية أساسية وهيدروجيل قذيفة.
فيما يلي إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية صنع أجهزة الموائع الدقيقة ، وكيفية تحضير الخلايا ، وكيفية إجراء تغليف hPSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
تؤدي عملية التغليف الموصوفة هنا إلى تكوين كروي hPSC قابل للتكرار. يجعل شكل الكبسولة الدقيقة من السهل توزيع الكرويات في آبار صفيحة ميكروتيتر للتجارب التي تهدف إلى تحسين / تحسين بروتوكولات التمايز أو اختبار العلاجات. يمكن أيضا استخدام كرويات الخلايا الجذعية المغلفة في مزارع التعليق حيث تحمي …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال المنح المقدمة من مركز Mayo Clinic للطب التجديدي ، ومؤسسة J. W. Kieckhefer ، ومؤسسة آل نهيان ، والطب التجديدي في مينيسوتا (RMM 101617 TR 004) ، والمعاهد الوطنية للصحة (DK107255).
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
Riferimenti
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
