Fabrication microfluidique de microcapsules noyau-coquille transportant des sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines
Summary
Cet article décrit l’encapsulation de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) à l’aide d’un dispositif de focalisation à flux coaxial. Nous démontrons que cette technologie d’encapsulation microfluidique permet la formation efficace de sphéroïdes hPSC.
Abstract
Les cultures tridimensionnelles (3D) ou sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) offrent les avantages d’une différenciation améliorée et d’une évolutivité améliorée. Dans cet article, nous décrivons une stratégie pour la formation robuste et reproductible de sphéroïdes hPSC où un dispositif de focalisation d’écoulement coaxial est utilisé pour piéger les hPSC à l’intérieur de microcapsules noyau-coque. La solution de base contenait une suspension unicellulaire de CSEh et a été rendue visqueuse par l’incorporation de poly(éthylène glycol) (PEG) de haut poids moléculaire et de milieux de gradient de densité. Le flux de coquille composé de maléimide de bras PEG-4 ou PEG-4-Mal et s’écoulait le long du flux de noyau vers deux jonctions pétrolières consécutives. La formation de gouttelettes s’est produite à la première jonction d’huile avec une solution de coquille s’enroulant autour du noyau. La réticulation chimique de la coquille s’est produite au deuxième carrefour d’huile en introduisant un réticulant di-thiol (1,4-dithiothréitol ou DTT) dans ces gouttelettes. Le réticulant réagit avec les groupes fonctionnels de maléimide via la chimie du clic, ce qui entraîne la formation d’une coquille d’hydrogel autour des microcapsules. Notre technologie d’encapsulation a produit des capsules de 400 μm de diamètre à raison de 10 capsules par seconde. Les capsules résultantes avaient une coquille d’hydrogel et un noyau aqueux qui permettaient aux cellules individuelles de s’assembler rapidement en agrégats et de former des sphéroïdes. Le processus d’encapsulation n’a pas eu d’effet négatif sur la viabilité des CSH, avec une viabilité de >95 % observée 3 jours après l’encapsulation. À titre de comparaison, les CSEh encapsulés dans des microparticules de gel solide (sans noyau aqueux) n’ont pas formé de sphéroïdes et avaient une viabilité de <50% 3 jours après l’encapsulation. La formation de sphéroïdes de CSEh à l’intérieur des microcapsules noyau-enveloppe s’est produite dans les 48 heures suivant l’encapsulation, le diamètre du sphéroïde étant fonction de la densité d’inoculation cellulaire. Dans l’ensemble, la technologie d’encapsulation microfluidique décrite dans ce protocole était bien adaptée à l’encapsulation des HSPC et à la formation de sphéroïdes.
Introduction
Il existe un intérêt considérable pour les cultures 3D de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) en raison de l’amélioration de la pluripotence et du potentiel de différenciation offerts par ce formatde culture 1,2,3. Les cSEh sont généralement formés en sphéroïdes ou en d’autres formats de culture 3D au moyen de bioréacteurs, de micropuits, d’hydrogels et d’échafaudages polymères 4,5,6. L’encapsulation offre un autre moyen d’organiser des hPSC simples en sphéroïdes. Une fois encapsulés, les sphéroïdes hPSC peuvent être manipulés facilement et transférés dans des plaques de microtitrage pour la différenciation, la modélisation de la maladie ou les expériences de test de médicaments. L’enrobage des CSEh dans une couche d’hydrogel protège également les cellules contre les dommages de cisaillement et permet de cultiver des sphéroïdes dans un bioréacteur à des taux d’agitation élevés7.
Notre méthodologie pour l’encapsulation des cellules souches a évolué au fil du temps. Tout d’abord, nous nous sommes concentrés sur les microparticules d’hydrogel solides et avons démontré le succès de l’encapsulation et de la culture de cellules souches embryonnaires (CSM) de souris8. Cependant, il a été noté que les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avaient une faible viabilité lorsqu’elles étaient encapsulées dans de telles microparticules d’hydrogel, probablement en raison de la plus grande nécessité pour ces cellules de rétablir les contacts cellule-cellule après l’encapsulation. Nous avons estimé que la microcapsule hétérogène, possédant un noyau aqueux, pourrait être mieux adaptée à l’encapsulation de cellules qui dépendent du rétablissement rapide des contacts cellule-cellule. Le concept de dispositif microfluidique de focalisation à écoulement coaxial pour la fabrication de microcapsules à noyau aqueux / coquille d’hydrogel a été adapté de He et al.9, mais au lieu de l’alginate utilisé dans l’approche originale, un hydrogel à base de PEG a été incorporé dans la coque. Nous avons d’abord démontré avec succès l’encapsulation et la formation de sphéroïdes d’hépatocytes primaires dans des microcapsules noyau-enveloppe10 et, plus récemment, nous avons décrit l’encapsulation de cellules hES et iPS7. Comme indiqué à la figure 1A, les capsules sont fabriquées dans un dispositif de focalisation de l’écoulement où la coque et les flux d’écoulement du noyau passent d’un flux d’un côté à l’autre à l’écoulement coaxial avant l’éjection dans la phase huileuse. Le flux de noyau contient des cellules et des additifs qui augmentent la viscosité de la solution (PEG MW 35kD non réactif et iodixanol – nom commercial OptiPrep) tandis que le flux de coquille contient des molécules réactives (PEG-4-Mal). Le flux d’écoulement coaxial continu est discrétisé en gouttelettes qui conservent l’architecture noyau-coque. La structure noyau-coquille est rendue permanente par l’exposition à un réticulant di-thiol (DTT), qui réagit avec le PEG-4-Mal via la chimie du clic et entraîne la formation d’une peau ou d’une coquille d’hydrogel mince (~ 10 μm). Une fois l’émulsion brisée et les capsules transférées en phase aqueuse, les molécules de PEG diffusent du noyau et sont remplacées par des molécules d’eau. Il en résulte des microcapsules aqueuses à noyau et à enveloppe d’hydrogel.
Vous trouverez ci-dessous des instructions étape par étape sur la fabrication de dispositifs microfluidiques, la préparation des cellules et l’encapsulation des CSEh.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le processus d’encapsulation décrit ici entraîne la formation reproductible de sphéroïdes hPSC. Le format microcapsule facilite la distribution de sphéroïdes dans les puits d’une plaque de microtitrage pour des expériences visant à améliorer / optimiser les protocoles de différenciation ou à tester des thérapies. Les sphéroïdes de cellules souches encapsulés peuvent également être utilisés dans des cultures en suspension où l’enveloppe d’hydrogel protège les cellules contre les dommages induit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue en partie par les subventions du Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, de la J. W. Kieckhefer Foundation, de la Al Nahyan Foundation, de Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) et des NIH (DK107255).
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
Riferimenti
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