मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल गोलाकार ले जाने वाले कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल का माइक्रोफ्लुइडिक फैब्रिकेशन
Summary
यह आलेख एक सह-अक्षीय प्रवाह फोकसिंग डिवाइस का उपयोग करके मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hPSCs) के encapsulation का वर्णन करता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह माइक्रोफ्लुइडिक एनकैप्सुलेशन तकनीक एचपीएससी गोलाकार के कुशल गठन को सक्षम बनाती है।
Abstract
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) की त्रि-आयामी (3 डी) या गोलाकार संस्कृतियां बेहतर भेदभाव परिणामों और स्केलेबिलिटी के लाभ प्रदान करती हैं। इस पेपर में, हम एचपीएससी गोलाकार के मजबूत और पुनरुत्पादक गठन के लिए एक रणनीति का वर्णन करते हैं जहां एक सह-अक्षीय प्रवाह फोकसिंग डिवाइस का उपयोग कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल के अंदर एचपीएससी को फंसाने के लिए किया जाता है। कोर समाधान में एचपीएससी का एकल सेल निलंबन शामिल था और उच्च आणविक भार पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (पीईजी) और घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया को शामिल करके चिपचिपा बनाया गया था। शेल स्ट्रीम में PEG-4 आर्म-मैलिमाइड या PEG-4-Mal शामिल थे और दो लगातार तेल जंक्शनों की ओर कोर स्ट्रीम के साथ बहते थे। ड्रॉपलेट गठन पहले तेल जंक्शन पर शेल समाधान के साथ कोर के चारों ओर खुद को लपेटने के साथ हुआ। इन बूंदों के लिए एक di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol या DTT) पेश करके दूसरे तेल जंक्शन पर शेल का रासायनिक क्रॉसलिंकिंग हुआ। क्रॉसलिंकर क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से मैलिमाइड कार्यात्मक समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोकैप्सूल के चारों ओर एक हाइड्रोजेल खोल का गठन होता है। हमारी encapsulation प्रौद्योगिकी प्रति सेकंड 10 कैप्सूल की दर से 400 μm व्यास कैप्सूल का उत्पादन किया। परिणामी कैप्सूल में एक हाइड्रोजेल खोल और एक जलीय कोर था जिसने एकल कोशिकाओं को तेजी से समुच्चय में इकट्ठा करने और गोलाकार बनाने की अनुमति दी थी। एनकैप्सुलेशन की प्रक्रिया ने एचपीएससी की व्यवहार्यता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित नहीं किया, जिसमें >95% व्यवहार्यता 3 दिनों के बाद एनकैप्सुलेशन देखी गई। तुलना के लिए, ठोस जेल सूक्ष्म कणों (एक जलीय कोर के बिना) में encapsulated hPSCs गोलाकार नहीं बनाते थे और encapsulation के 3 दिन बाद <50% व्यवहार्यता थी। कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल के अंदर एचपीएससी का गोलाकार गठन एनकैप्सुलेशन के बाद 48 घंटे के भीतर हुआ, जिसमें गोलाकार व्यास सेल इनोक्यूलेशन घनत्व का एक कार्य था। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल में वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक एनकैप्सुलेशन तकनीक एचपीएससी एनकैप्सुलेशन और गोलाकार गठन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल थी।
Introduction
इस संस्कृति प्रारूप 1,2,3 द्वारा प्रदान की गई बेहतर प्लूरिबिलिटी और भेदभाव क्षमता के कारण मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी)की 3 डी संस्कृतियों में काफी रुचि है। hPSCs आमतौर पर बायोरिएक्टर, microwells, hydrogels, और बहुलक scaffolds 4,5,6 के माध्यम से गोलाकार या अन्य 3 डी संस्कृति प्रारूपों में गठित कर रहे हैं। Encapsulation गोलाकार में एकल hPSCs के आयोजन के लिए एक और साधन प्रदान करता है। एक बार encapsulated hPSC गोलाकार आसानी से संभाला जा सकता है और भेदभाव, रोग मॉडलिंग, या दवा परीक्षण प्रयोगों के लिए माइक्रोटिटर प्लेटों में स्थानांतरित किया जा सकता है। एक हाइड्रोजेल परत में hPSCs encasing भी कतरनी क्षति के खिलाफ कोशिकाओं की रक्षा करता है और सरगर्मी 7 की उच्च दर पर एक बायोरिएक्टर में गोलाकार संस्कृति की अनुमति देताहै।
स्टेम सेल encapsulation के लिए हमारी पद्धति समय के साथ विकसित हुई। सबसे पहले, हमने ठोस हाइड्रोजेल सूक्ष्म कणों पर ध्यान केंद्रित किया और माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs) 8 की सफल encapsulation और खेती का प्रदर्शन किया। हालांकि, यह ध्यान दिया गया था कि मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में कम व्यवहार्यता थी जब इस तरह के हाइड्रोजेल सूक्ष्म कणों में समझाया गया था, संभवतः इन कोशिकाओं को एनकैप्सुलेशन के बाद सेल-सेल संपर्कों को फिर से स्थापित करने की अधिक आवश्यकता के कारण। हमने तर्क दिया कि विषम माइक्रोकैप्सूल, एक जलीय कोर रखने वाले, कोशिकाओं के encapsulation के लिए बेहतर अनुकूल हो सकते हैं जो सेल-सेल संपर्कों की तेजी से पुन: स्थापना पर भरोसा करते हैं। जलीय कोर / हाइड्रोजेल शेल माइक्रोकैप्सूल बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस पर ध्यान केंद्रित करने वाले सह-अक्षीय प्रवाह की अवधारणा को He et al.9 से अनुकूलित किया गया था, लेकिन मूल दृष्टिकोण में नियोजित एल्गिनेट के बजाय, एक पीईजी-आधारित हाइड्रोजेल को खोल में शामिल किया गया था। हमने पहली बार कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल्स10 में प्राथमिक हेपेटोसाइट के सफल एनकैप्सुलेशन और गोलाकार गठन का प्रदर्शन किया और हाल ही में एचईएस और आईपीएस कोशिकाओं केएनकैप्सुलेशन का वर्णन किया। जैसा कि चित्रा 1 ए में उल्लिखित है, कैप्सूल को एक प्रवाह फोकसिंग डिवाइस में गढ़ा जाता है जहां शेल और कोर प्रवाह धाराएं तेल चरण में इजेक्शन से पहले साइड-टू-साइड से सह-अक्षीय प्रवाह में संक्रमण करती हैं। कोर प्रवाह में कोशिकाएं और एडिटिव्स होते हैं जो समाधान की चिपचिपाहट को बढ़ाते हैं (गैर-प्रतिक्रियाशील PEG MW 35kD और iodixanol – वाणिज्यिक नाम OptiPrep) जबकि शेल स्ट्रीम में प्रतिक्रियाशील अणु (PEG-4-Mal) होते हैं। निरंतर सह-अक्षीय प्रवाह धारा को बूंदों में विभाजित किया जाता है जो कोर-शेल आर्किटेक्चर को बनाए रखते हैं। कोर-शेल संरचना को डी-थिओल क्रॉसलिंकर (डीटीटी) के संपर्क में आने से स्थायी बनाया जाता है, जो क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से PEG-4-Mal के साथ प्रतिक्रिया करता है और परिणामस्वरूप एक पतली (~ 10 μm) हाइड्रोजेल त्वचा या खोल का गठन होता है। इमल्शन टूटने के बाद और कैप्सूल को एक जलीय चरण में स्थानांतरित कर दिया जाता है, पीईजी के अणु कोर से फैलते हैं और पानी के अणुओं द्वारा प्रतिस्थापित किए जाते हैं। इसके परिणामस्वरूप जलीय कोर और हाइड्रोजेल शेल माइक्रोकैप्सूल होते हैं।
नीचे दिए गए चरण-दर-चरण निर्देश हैं कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण कैसे बनाएं, कोशिकाओं को कैसे तैयार किया जाए, और एचपीएससी के एनकैप्सुलेशन को कैसे पूरा किया जाए।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित encapsulation प्रक्रिया hPSC गोलाकार के पुनरुत्पादक गठन में परिणाम है। माइक्रोकैप्सूल प्रारूप भेदभाव प्रोटोकॉल में सुधार / अनुकूलन या परीक्षण उपचार के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए एक माइक्रोटिटर प्…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को मेयो क्लिनिक सेंटर फॉर रीजेनरेटिव मेडिसिन, जे डब्ल्यू किचेफर फाउंडेशन, अल नाहयान फाउंडेशन, पुनर्योजी चिकित्सा मिनेसोटा (आरएमएम 101617 टीआर 004), और एनआईएच (डीके 107255) से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
Riferimenti
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