Mikrofluidisk fabrikasjon av kjerneskallmikrokapsler som bærer humane pluripotente stamcellesfæroider
Summary
Denne artikkelen beskriver innkapsling av humane pluripotente stamceller (hPSCer) ved hjelp av en koaksial strømningsfokuseringsenhet. Vi viser at denne mikrofluidiske innkapslingsteknologien muliggjør effektiv dannelse av hPSC-sfæroider.
Abstract
Tredimensjonale (3D) eller sfæroidkulturer av humane pluripotente stamceller (hPSCer) gir fordelene med forbedrede differensieringsresultater og skalerbarhet. I dette dokumentet beskriver vi en strategi for robust og reproduserbar dannelse av hPSC-sfæroider der en koaksial strømningsfokuseringsenhet brukes til å fange hPSCer inne i mikrokapsler av kjerneskall. Kjerneløsningen inneholdt encellet suspensjon av hPSCer og ble gjort viskøst ved inkorporering av høymolekylær poly (etylenglykol) (PEG) og tetthet gradient media. Skallstrømmen består av PEG-4 arm-maleimid eller PEG-4-Mal og strømmet sammen med kjernestrømmen mot to påfølgende oljekryss. Dråpeformasjonen skjedde ved det første oljekrysset med skallløsning som pakket seg rundt kjernen. Kjemisk krysskobling av skallet skjedde ved det andre oljekrysset ved å introdusere en di-tiol crosslinker (1,4-dithiothreitol eller DTT) til disse dråpene. Crosslinker reagerer med maleimid funksjonelle grupper via klikkkjemi, noe som resulterer i dannelsen av et hydrogelskall rundt mikrokapsler. Vår innkapslingsteknologi produserte kapsler med 400 μm diameter med en hastighet på 10 kapsler per sekund. De resulterende kapslene hadde et hydrogelskall og en vandig kjerne som gjorde det mulig for enkeltceller å raskt montere seg i aggregater og danne sfæroider. Innkapslingsprosessen påvirket ikke levedyktigheten til hPSCer negativt, med >95% levedyktighet observert 3 dager etter innkapsling. Til sammenligning dannet hPSCs innkapslet i faste gelmikropartikler (uten en vandig kjerne) ikke sfæroider og hadde <50% levedyktighet 3 dager etter innkapsling. Sfæroiddannelse av hPSCer inne i mikrokapsler av kjerneskall oppstod innen 48 timer etter innkapsling, med sfæroiddiameteren som en funksjon av celleinokuleringstetthet. Samlet sett var den mikrofluidiske innkapslingsteknologien beskrevet i denne protokollen godt egnet for hPSCs innkapsling og sfæroiddannelse.
Introduction
Det er stor interesse for 3D-kulturer av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) på grunn av forbedret pluripotens og differensieringspotensial gitt av dette kulturformatet 1,2,3. hPSCer dannes vanligvis til sfæroider eller andre 3D-kulturformater ved hjelp av bioreaktorer, mikrowells, hydrogeler og polymere stillaser 4,5,6. Innkapsling tilbyr et annet middel for å organisere enkle hPSCer i sfæroider. Når innkapslede hPSC sfæroider kan håndteres med letthett og overføres til mikrotiterplater for differensiering, sykdomsmodellering eller narkotikatesting eksperimenter. Innkapslet hPSCs i et hydrogellag beskytter også celler mot skjærskader og gjør det mulig å dyrke sfæroider i en bioreaktor ved høye omrøringshastigheter7.
Vår metodikk for stamcelleinnkapsling utviklet seg over tid. For det første fokuserte vi på faste hydrogelmikropartikler og demonstrerte vellykket innkapsling og dyrking av museembrenne stamceller (mESCs)8. Det ble imidlertid bemerket at humane embryonale stamceller (hESCs) hadde lav levedyktighet når de ble innkapslet i slike hydrogelmikropartikler, antagelig på grunn av større behov for at disse cellene gjenoppretter cellecellekontakter etter innkapslingen. Vi begrunnet det med at heterogen mikrokapsel, som har en vandig kjerne, kan være bedre egnet for innkapsling av celler som er avhengige av rask reetablering av cellecellekontakter. Konseptet med koaksial strømningsfokusering av mikrofluidisk enhet for å lage vandige mikrokapsler av kjerne/hydrogelskall ble tilpasset fra He et al.9, men i stedet for alginat ansatt i den opprinnelige tilnærmingen, ble en PEG-basert hydrogel innlemmet i skallet. Vi viste først vellykket innkapsling og sfæroiddannelse av primær hepatocytt i kjerneskallmikrokapsler10 og sist beskrevet innkapsling av hES- og iPS-celler7. Som beskrevet i figur 1A, fremstilles kapsler i en strømningsfokuseringsenhet der skall- og kjernestrømstrømmene går fra side til side til koaksial strømning før utkast til oljefasen. Kjernestrømmen inneholder celler og tilsetningsstoffer som øker viskositeten til løsningen (ikke-reaktiv PEG MW 35kD og iodixanol – kommersielt navn OptiPrep) mens skallstrømmen inneholder reaktive molekyler (PEG-4-Mal). Kontinuerlig koaksial strømningsstrøm er atskilt i dråper som beholder kjerneskallarkitektur. Kjerneskallstrukturen gjøres permanent ved eksponering for di-tiol crosslinker (DTT), som reagerer med PEG-4-Mal via klikkkjemi og resulterer i dannelse av en tynn (~ 10 μm) hydrogelhud eller skall. Etter at emulsjonen er brutt og kapsler overføres til en vandig fase, diffuse molekyler av PEG fra kjernen og erstattes av vannmolekyler. Dette resulterer i vandig kjerne og hydrogel skall mikrokapsler.
Nedenfor finner du trinnvise instruksjoner om hvordan du lager mikrofluidiske enheter, hvordan du klargjør celler og hvordan du utfører innkapsling av hPSCer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Innkapslingsprosessen som er beskrevet her, resulterer i reproduserbar dannelse av hPSC-sfæroider. Mikrokapselformatet gjør det enkelt å dispensere sfæroider i brønner på en mikrotiterplate for eksperimenter som tar sikte på å forbedre / optimalisere differensieringsprotokoller eller testterapier. Innkapslede stamcellesfæroider kan også brukes i suspensjonskulturer der hydrogelskall beskytter celler mot skjærindusert skade7.
Det er flere kritiske trinn i prot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble delvis støttet av tilskuddene fra Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) og NIH (DK107255).
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
Riferimenti
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
