JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

Published: August 05, 2022
doi:
10.3791/62949
, ,
1Department of Chemistry,Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry,Bucknell University

Summary

ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي هي أهداف محتملة لأدوية السرطان. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتقييم الجزيئات الصغيرة لتثبيط ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي. يستخدم هذا الفحص نوكلياز داخلي لإقران مثيلة الحمض النووي بتوليد التألق ويسمح بمراقبة نشاط الإنزيم في الوقت الفعلي.

Abstract

مثيلة الحمض النووي ، وهي شكل من أشكال تنظيم الجينات اللاجينية ، مهمة للوظيفة الخلوية الطبيعية. في الخلايا ، تنشئ البروتينات التي تسمى DNA methyltransferases (DNMTs) نمط مثيلة الحمض النووي وتحافظ عليه. ترتبط التغييرات في نمط مثيلة الحمض النووي الطبيعي بتطور السرطان وتطوره ، مما يجعل DNMTs أهدافا محتملة لأدوية السرطان. وبالتالي ، فإن تحديد وتوصيف مثبطات الجزيئات الصغيرة الجديدة لهذه الإنزيمات له أهمية كبيرة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يمكن استخدامه للكشف عن مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي. يسمح اختبار الحركية المقترنة المستمرة بتحديد السرعات الأولية لمثيلة الحمض النووي في وجود وغياب مثبطات الجزيئات الصغيرة المحتملة. يستخدم الفحص نوكلياز Gla I الحساس للميثيل لإقران مثيلة ركيزة الحمض النووي hemimethylated لتوليد مضان.

يسمح هذا الفحص المستمر بمراقبة نشاط الإنزيم في الوقت الفعلي. إجراء الفحص بكميات صغيرة في ألواح المعايرة الدقيقة يقلل من تكلفة الكواشف. باستخدام هذا الفحص ، تم إجراء شاشة مثال صغير لمثبطات DNMT1 ، وهو إيزوزيم DNMT الأكثر وفرة في البشر. المنتج الطبيعي للأنثراكينون عالي الاستبدال ، حمض اللاكايك A ، هو مثبط قوي ومنافس للحمض النووي ل DNMT1. هنا ، نفحص ثلاثة مثبطات جزيئات صغيرة محتملة – أنثراكينون أو جزيئات شبيهة بالأنثراكينون مع واحد إلى ثلاثة بدائل – بتركيزين لوصف بروتوكول الفحص. تستخدم السرعات الأولية لحساب النسبة المئوية للنشاط الملاحظ في وجود كل جزيء. يظهر أحد المركبات الثلاثة التي تم فحصها تثبيطا يعتمد على التركيز لنشاط DNMT1 ، مما يشير إلى أنه مثبط محتمل ل DNMT1.

Introduction

مثيلة الحمض النووي هي علامة جينية مهمة تنظم التعبير الجيني وبنية الكروماتين. يحدث المثيلة في الغالب في ثنائي النوكليوتيدات CpG – السيتوزين يليه جوانوزين. تضاف مجموعة الميثيل إلى موضع 5 من السيتوزين. هناك حاجة إلى أنماط مثيلة الحمض النووي الصحيحة ، وبالتالي التعبير الجيني المناسب ، من أجل التطور والوظيفة الخلوية المناسبة. ارتبطت العديد من حالات المرض بالتغيرات في نمط المثيلة الطبيعي1،2،3. على سبيل المثال ، هناك صلة بين بدء السرطان وتقدمه والتعديلات في نمط مثيلة الحمض النووي. عادة ، تظهر الخلايا السرطانية مستويات إجمالية أقل من ميثيل سيتوزين ، مما يساهم في عدم استقرار الجينوم. في الوقت نفسه ، يتركز ميثيل السيتوزين الموجود في الجينوم في المناطق المروجة للجينات المثبطة للورم ، مما يؤدي إلى إسكات الجينات لهذه البروتينات المهمة. والجدير بالذكر أن التغيرات اللاجينية ديناميكية وقابلة للعكس ، على عكس طفرات الحمض النووي المرتبطة بتكوين الأورام. وقد جعل هذا البروتينات المشاركة في تنظيم الجينات اللاجينية أهدافا دوائية مثيرة للاهتمام 2,4.

ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (DNMTs) هي البروتينات المسؤولة عن توليد والحفاظ على أنماط مثيلة الحمض النووي. توجد ثلاثة إيزوزيمات نشطة تحفيزيا ، DNMT1 و DNMT3a و DNMT3b ، في البشر. أثناء التطوير والتمايز ، تنشئ دي نوفو ميثيل ترانسفيراز ، DNMT3a و DNMT3b ، أنماط مثيلة. يمكن لكلا الإنزيمين ربط بروتين DNMT3L غير النشط تحفيزيا لتشكيل مجمعات تظهر نشاطا متزايدا 1,5. بعد انقسام الخلايا ، تحتوي الخلايا البنوية على الحمض النووي نصف الميثيل – الحمض النووي الذي يحتوي على ميثيل السيتوزين في شريط واحد فقط من الازدواج – لأن الحمض النووي المركب حديثا يخلو من علامات المثيلة. تتمثل الوظيفة الرئيسية ل DNMT1 في ميثيل هذا الحمض النووي نصف الميثيل ، وبالتالي إعادة إنشاء نمط المثيلة الكامل 1,5.

الروابط بين نشاط DNMT والسرطان راسخة. الإفراط في التعبير عن DNMT1 ، إما عن طريق آليات النسخ أو ما بعد الترجمة ، هو نتيجة للعديد من مسارات الأورام الشائعة6،7،8،9. تؤدي الأساليب الجينية لخفض نشاط DNMT1 باستخدام الأليلات ناقصة الشكل إلى انخفاض تكوين الورم في الفئران Apc (Min) 10. oligonucleotides المضادة للحساسية التي تمنع DNMT1 الأورام في زراعة الخلايا ونماذج ورم الفأر11,12. وبالتالي ، فإن تثبيط نشاط DNMT1 يبدو وكأنه نهج واعد لعلاج السرطان. ومع ذلك ، فإن الأدوار التي تلعبها إيزوزيمات DNMT3 ليست بهذه البساطة. تم العثور على طفرات DNMT3a في سرطان الدم النخاعي الحاد13 ومتلازمة خلل التنسج النقوي14. ثبت أن طفرة واحدة على الأقل من الطفرات المحددة تقلل من نشاط مثيلة الحمض النووي للإنزيم15. ومع ذلك ، يتم التعبير عن DNMT3b بشكل مفرط في سرطان الثدي16 وسرطان القولون والمستقيم17. مع لعب إيزوزيمات DNMT المختلفة أدوارا مختلفة في التسرطن ، فإن تحديد مثبطات الإيزوزيم الخاصة سيكون أمرا بالغ الأهمية. لن تكون هذه المركبات مفيدة فقط لتطوير العلاجات ، ولكن مثبطات الإيزوزيم الخاصة ستكون أيضا أداة لا تقدر بثمن لتشريح دور كل إيزوزيم DNMT في مسببات السرطان.

تم الإبلاغ عن العديد من مثبطات DNMT في الأدبيات. يمكن تقسيم مثبطات DNMT المعروفة إلى فئتين: النوكليوزيد وغير النيوكليوسيد. مثبطات النيوكليوزيد هي عادة نظائر السيتيدين. يتم دمج هذه المركبات في الحمض النووي وتحبس DNMTs تساهميا. تمت الموافقة على 5-azacytidine و 5-aza-2′-deoxycytidine لعلاج متلازمة خلل التنسج النقوي وسرطان الدم النخاعي الحاد4،18. تمثل السمية العالية والتوافر البيولوجي المنخفض وعدم الاستقرار الكيميائي لهذه المركبات مشاكل. العمل الجاري هو دراسة فعالية الجيل القادم من مثبطات النيوكليوسيد. SGI-110 ، المشتق من 5-aza-2′-deoxycytidine ، هو أحد الأمثلة19,20. مثبطات النيوكليوزيد ليست خاصة بالإيزوزيم وستعطل أي إيزوزيم DNMT تمت مواجهته. لذلك ، يؤدي العلاج بعامل إزالة الميثيل من النوكليوزيد إلى استنفاد جميع إيزوزيمات DNMT 4,18. لا يلزم دمج مثبطات غير النوكليوزيد في الحمض النووي لممارسة آثارها المثبطة. بدلا من ذلك ، ترتبط هذه الجزيئات مباشرة ب DNMTs ، مما يوفر إمكانية تثبيط خاص بالإيزوزيم. تم اكتشاف العديد من مثبطات غير النوكليوزيد حتى الآن ، بما في ذلك SGI-1027 21 ، و hydralazine 22 ، و procainamide 23 ، و RG108 ومشتقاته24 ، والمنتجات الطبيعية ، (-) -epigallocatechin 3-gallate (EGCG) 25 وحمض اللاكايكA 26,27. معظم مثبطات غير النوكليوزيد المكتشفة حتى الآن ليست انتقائية للأيزوزيم أو تظهر تفضيلات ضعيفة لإيزوزيم DNMT واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تحسين فاعلية هذه الجزيئات ، خاصة في الخلايا 4,18. وبالتالي ، هناك حاجة لاكتشاف أو تطوير مثبطات DNMT أكثر قوة وانتقائية للأيزوزيم.

تتمثل إحدى العقبات التي تحول دون اكتشاف مثبطات جزيئات صغيرة جديدة ل DNMTs في المقايسات الشاقة المستخدمة تقليديا لفحص نشاط DNMT28. عادة ما تكون المقايسات متقطعة بخطوات متعددة. لا يزال النشاط الأنزيمي ل DNMTs يتم فحصه بشكل روتيني باستخدام ميثيونين S-adenosyl المشع (SAM) 29،30،31،32،33،34. كما تم تطوير مقايسات غير مشعة لمثيلة الحمض النووي. على سبيل المثال ، تم وصف المقايسات التي تستخدم نوكلياز تقييد حساسية للميثيل والرحلان الكهربائي لفصل منتجات الهضم35,36. هذه الأنواع من المقايسات المتقطعة متعددة الخطوات ليست قابلة بسهولة لاكتشاف الأدوية. منذ منتصف عام 2000 ، تم تطوير العديد من فحوصات مثيلة الحمض النووي ذات الإنتاجية الأعلى28. تم استخدام اختبار القرب التلألؤ للكشف عن مثبطات DNMT137. تم استخدام اختبار آخر يستخدم نوكلياز تقييد حساسية للميثيل للكشف عن مثبطات DNMT3a25,38. في حين أن كلا الاختبارين يسمحان بإنتاجية أعلى من مقايسات مثيلة الحمض النووي التقليدية ، فإن المقايسات تتطلب خطوات متعددة ولا تسمح بمراقبة نشاط المثيلة في الوقت الفعلي. في الآونة الأخيرة ، تم وصف مقايسة حركية مستمرة تجمع بين تكوين S-adenosylhomocysteine (SAH) ، وهو أحد منتجات تفاعل المثيلة ، والتغير الطيفي عند 340 نانومتر المرتبط بأكسدة NADPH39. يستخدم هذا الفحص ثلاثة إنزيمات اقتران لتوليد إشارة طيفية.

لقد طورنا مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بنوكلياز داخلية قائمة على التألق والتي تستخدم إنزيم اقتران واحد متاح تجاريا ويمكنها توليد البيانات في الوقت الفعلي (الشكل 1). يستخدم قليل النوكليوتيد الذي يحتوي على ثلاثة ميثيل سيتوزين كركيزة. يحتوي الحمض النووي للركيزة على فلوروفور في الطرف 5 ‘ومطفئ في الطرف 3’. تولد مثيلة موقع CpG نصف الميثيل موقع الانقسام للنوكلياز الداخلي Gla I – GCGC الميثيلي بالكامل. Gla I انشقاق المنتج قليل النوكليوتيد يطلق الفلوروفور من المروي ويولد مضان في الوقت الحقيقي. يمكن استخدام الفحص لفحص نشاط أي شكل متساوي من DNMT ؛ ومع ذلك ، لوحظ نشاط أعلى مع DNMT1 حيث أن هذا الإيزوزيم يثيل بشكل تفضيلي الحمض النووينصف الميثيل 1,5. ويلاحظ نشاط أكثر قوة إذا تمت إزالة مجال تسلسل استهداف بؤر النسخ المتماثل (RFTS) المثبط ذاتيا من DNMT1. يرتبط هذا المجال ، الموجود في المنطقة التنظيمية N-terminal ، بالموقع الحفاز ويمنع ارتباط الحمض النووي. تؤدي إزالة أول ~ 600 من الأحماض الأمينية إلى إنزيم مقطوع أكثر نشاطا بشكل ملحوظ من الإنزيم كامل الطول (~ زيادة 640 ضعفا في kcat / Km) 40. يسمح هذا الشكل المنشط من الإنزيم ، المشار إليه باسم DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS (الأحماض الأمينية 621-1616) ، بتحديد أسهل للمثبطات بسبب قوته التحفيزية المتزايدة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لاستخدام DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في المقايسات لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة المحتملة. باستخدام الفحص المستمر المقترن بالنوكلياز الداخلي ، يتم تحديد السرعة الأولية في وجود وغياب عدد قليل من الجزيئات الصغيرة. يتم فحص كل مثبط محتمل بتركيزين للبحث عن تثبيط DNMT1 المعتمد على التركيز. تم حساب النسبة المئوية للنشاط الذي لوحظ في وجود الجزيئات الصغيرة في كل حالة.

Figure 1
الشكل 1: مقايسة مثيلة الحمض النووي. يتم استخدام الحمض النووي لدبوس الشعر hemimethylated مع فلوروفور في نهاية 5 ‘ومطفأ على نهاية 3’ كركيزة. يحفز DNMT1 نقل مجموعة الميثيل من S-adenosylmethionine إلى موقع CpG غير الميثيل ، مما يولد S-adenosylhomocysteine والحمض النووي الميثيلي بالكامل. يحتوي منتج الحمض النووي على موقع الانقسام للنوكلياز الداخلي Gla I ، الذي يشق مواقع GCGC الميثلية بالكامل. يؤدي انشقاق الحمض النووي للمنتج إلى إطلاق الفلوروفور 5 بوصات من مخوي 3 بوصات ، مما يولد مضان. الاختصارات: Fl = فلوروفور. س = مروي. DNMT1 = الحمض النووي ميثيل ترانسفيراز 1 ؛ SAM = S-أدينوسيل ميثيونين. SAH = S-أدينوسيل هوموسيستين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Protocol

1. إعداد حلول الفحص للشاشة ملاحظة: يمكن تكييف تركيزات الركائز المستخدمة في هذا الفحص. بالنسبة إلى DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS ، فإن قيم Km المحددة تجريبيا لركيزة الحمض النووي لدبوس الشعر و SAM هي 1-2 نانومتر و 2 ميكرومتر ، على التوالي26,40. <o…

Representative Results

DNMT1 النشط هو شرط أساسي لهذا التحليل. تم التعبير عن DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في E.coli وتم تنقيته إلى التجانس باتباع الإجراءات المنشورة مسبقا41. للتأكد من أن الإنزيم المنقى كان نشطا ، تم استخدام مقايسة متقطعة مقترنة بالنوكلياز الداخلي لفحص نشاط مثيلة الحمض النووي36. ي?…

Discussion

لتحديد وتوصيف مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي ، يجب قياس نشاط الإنزيم. توجد عدة طرق لفحص نشاط ميثيل ترانسفيراز DNA. عادة ما يتم رصد النشاط باستخدام النشاط الإشعاعي. يمكن قياس نقل مجموعة الميثيل الموسومة من SAM29،30،31،32،33<…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون جامعة باكنيل وقسم الكيمياء على دعمهم لهذا العمل.

Materials

96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate Corning 3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates ThermoFisher 249570
Bovine Serum Albumin NEB B9000S
compound 1 ChemBridge 5812086 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2 ChemBridge 6722175 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3 ChemBridge 5249376 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol Sigma D0632
Gla I SibEnzyme E494 methyl-sensitive endonuclease
Glycerol RPI G22025
Magnesium Chloride Sigma M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) IDT custom synthesized internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate Sigma G1501
S-adenosylmethionine Sigma A4377 methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base RPI T60040
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3′-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Ricerca sul cancro. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what’s next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2′-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Ricerca sul cancro. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochimica. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochimica. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).

Tags

Keywords: Continuous Fluorescence-based AssayEndonuclease-coupledDNA Methyltransferase InhibitorsPlate Reader AssayReal-time Data CollectionDNA MethylationSAMGlaIDNMT1DNA SubstrateInhibitor Screening
check_url/it/62949?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Switzer, R., Ward, K. A., Medrano, J. Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (186), e62949, doi:10.3791/62949 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image