Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Summary

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Abstract

DNA-Methylierung, eine Form der epigenetischen Genregulation, ist wichtig für die normale Zellfunktion. In Zellen etablieren und erhalten Proteine, die DNA-Methyltransferasen (DNMTs) genannt werden, das DNA-Methylierungsmuster. Veränderungen des normalen DNA-Methylierungsmusters sind mit der Entwicklung und Progression von Krebs verbunden, was DNMTs zu potenziellen Zielen für Krebsmedikamente macht. Daher ist die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger niedermolekularer Inhibitoren dieser Enzyme von großer Bedeutung. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das verwendet werden kann, um nach DNA-Methyltransferase-Inhibitoren zu suchen. Der Test der kontinuierlichen gekoppelten Kinetik ermöglicht es, die Anfangsgeschwindigkeiten der DNA-Methylierung in Gegenwart und Abwesenheit potenzieller niedermolekularer Inhibitoren zu bestimmen. Der Assay verwendet die methylsensitive Endonuklease Gla I, um die Methylierung eines hemimethylierten DNA-Substrats an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln.

Dieser kontinuierliche Assay ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit. Die Durchführung des Assays in kleinen Volumina in Mikrotiterplatten reduziert die Kosten für Reagenzien. Mit diesem Assay wurde ein kleines Beispiel-Screening für Inhibitoren von DNMT1, dem am häufigsten vorkommenden DNMT-Isoenzym beim Menschen, durchgeführt. Das hochsubstituierte Anthrachinon-Naturprodukt Milchsäure A ist ein potenter, DNA-kompetitiver Inhibitor von DNMT1. Hier untersuchen wir drei potenzielle niedermolekulare Inhibitoren – Anthrachinone oder Anthrachinon-ähnliche Moleküle mit ein bis drei Substituenten – in zwei Konzentrationen, um das Assay-Protokoll zu beschreiben. Anfangsgeschwindigkeiten werden verwendet, um die prozentuale Aktivität zu berechnen, die in Gegenwart jedes Moleküls beobachtet wird. Eine der drei untersuchten Verbindungen weist eine konzentrationsabhängige Hemmung der DNMT1-Aktivität auf, was darauf hindeutet, dass es sich um einen potenziellen Inhibitor von DNMT1 handelt.

Introduction

DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Markierung, die die Genexpression und die Chromatinstruktur reguliert. Die Methylierung erfolgt überwiegend in CpG-Dinukleotiden – Cytosin gefolgt von Guanosin; Die Methylgruppe wird zur 5-Position von Cytosin hinzugefügt. Korrekte DNA-Methylierungsmuster und damit die richtige Genexpression sind für eine angemessene zelluläre Entwicklung und Funktion erforderlich. Viele Krankheitszustände wurden mit Veränderungen des normalen Methylierungsmusters ^1,2,3 in Verbindung gebracht. Zum Beispiel gibt es einen Zusammenhang zwischen Krebsentstehung und -progression und Veränderungen des DNA-Methylierungsmusters. Typischerweise weisen Krebszellen insgesamt niedrigere Methylcytosinspiegel auf, was zur Instabilität des Genoms beiträgt. Gleichzeitig konzentriert sich das im Erbgut vorhandene Methylcytosin in den Promotorregionen von Tumorsuppressorgenen, was zu einer Gen-Silencierung dieser wichtigen Proteine führt. Insbesondere epigenetische Veränderungen sind dynamisch und reversibel, im Gegensatz zu den DNA-Mutationen, die mit der Tumorgenese assoziiert sind. Dies hat die Proteine, die an der epigenetischen Genregulation beteiligt sind, zu interessanten^{Wirkstoffzielen 2,4} gemacht.

DNA-Methyltransferasen (DNMTs) sind die Proteine, die für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von DNA-Methylierungsmustern verantwortlich sind. Drei katalytisch aktive Isoenzyme, DNMT1, DNMT3a und DNMT3b, existieren beim Menschen. Während der Entwicklung und Differenzierung etablieren die de novo Methyltransferasen DNMT3a und DNMT3b Methylierungsmuster. Beide Enzyme können das katalytisch inaktive DNMT3L-Protein zu Komplexen binden, die eine erhöhte Aktivität^{aufweisen 1,5}. Nach der Zellteilung enthalten Tochterzellen hemimethylierte DNA – DNA, die Methylcytosin in nur einem Strang des Duplex enthält -, weil die neu synthetisierte DNA frei von Methylierungsmarkierungen ist. Die Hauptfunktion von DNMT1 besteht darin, diese hemimethylierte DNA zu methylieren, wodurch das vollständige Methylierungsmuster ^1,5 wiederhergestellt wird.

Zusammenhänge zwischen DNMT-Aktivität und Krebs sind gut etabliert. Die Überexpression von DNMT1, entweder durch transkriptionelle oder posttranslationale Mechanismen, ist eine Folge mehrerer gemeinsamer onkogener Signalwege 6,7,8,9. Genetische Ansätze zur Senkung der DNMT1-Aktivität unter Verwendung hypomorpher Allele führen zu einer verminderten Tumorbildung bei Apc^(Min)Mäusen¹⁰. Antisense-Oligonukleotide, die DNMT1 niederschlagen, hemmen Neoplasien in Zellkultur- und^{Maustumormodellen 11,12}. Daher scheint die Hemmung der DNMT1-Aktivität ein vielversprechender Krebstherapieansatz zu sein. Die Rollen, die die DNMT3-Isoenzyme spielen, sind jedoch nicht so einfach. DNMT3a-Mutationen finden sich bei akuter myeloischer Leukämie¹³ und myelodysplastischem Syndrom¹⁴. Es wurde gezeigt, dass mindestens eine der identifizierten Mutationen die DNA-Methylierungsaktivität des Enzyms¹⁵ verringert. DNMT3b ist jedoch bei Brustkrebs¹⁶ und Darmkrebs¹⁷ überexprimiert. Da die verschiedenen DNMT-Isoenzyme unterschiedliche Rollen bei der Karzinogenese spielen, wird die Identifizierung isoenzymspezifischer Inhibitoren entscheidend sein. Diese Verbindungen werden nicht nur für die Entwicklung von Therapeutika nützlich sein, sondern isoenzymspezifische Inhibitoren wären auch ein unschätzbares Werkzeug, um die Rolle jedes DNMT-Isoenzyms in der Krebsätiologie zu analysieren.

Mehrere DNMT-Inhibitoren wurden in der Literatur beschrieben. Bekannte DNMT-Inhibitoren können in zwei Klassen unterteilt werden: Nukleosid und Nicht-Nukleosid. Nukleosidinhibitoren sind typischerweise Cytidinanaloga. Diese Verbindungen werden in die DNA eingebaut und fangen DNMTs kovalent ein. 5-Azacytidin und 5-Aza-2′-Desoxycytidin sind für die Behandlung des myelodysplastischen Syndroms und der akuten myeloischen Leukämie zugelassen ^4,18. Die hohe Toxizität, geringe Bioverfügbarkeit und chemische Instabilität dieser Verbindungen stellen Probleme dar. Laufende Arbeiten untersuchen die Wirksamkeit der nächsten Generation von Nukleosidinhibitoren; SGI-110, abgeleitet von 5-Aza-2′-Desoxycytidin, ist ein Beispiel^19,20. Nukleosid-Inhibitoren sind nicht isoenzymspezifisch und inaktivieren jedes auftretende DNMT-Isoenzym. Daher führt die Behandlung mit einem nukleosiddemethylierenden Mittel zur Erschöpfung aller DNMT-Isoenzyme ^4,18. Nicht-Nukleosid-Inhibitoren müssen nicht in die DNA eingebaut werden, um ihre hemmende Wirkung auszuüben. Stattdessen binden diese Moleküle direkt an DNMTs, was die Möglichkeit einer isoenzymspezifischen Hemmung einführt. Bisher wurden mehrere Nicht-Nukleosid-Inhibitoren entdeckt, darunter SGI-1027 21, Hydralazin-22, Procainamid²³, RG108 und Derivate 24 sowie die Naturstoffe (−)-Epigallocateching-3-Gallat (EGCG)25 und Milchsäure A ^26,27. Die meisten der bisher entdeckten Nicht-Nukleosid-Inhibitoren sind nicht isoenzymselektiv oder zeigen schwache Präferenzen für ein DNMT-Isoenzym. Darüber hinaus muss die Wirksamkeit dieser Moleküle verbessert werden, insbesondere in Zellen ^4,18. Daher besteht die Notwendigkeit, potentere, isoenzymselektive DNMT-Inhibitoren zu entdecken oder zu entwickeln.

Eine Hürde bei der Entdeckung neuer niedermolekularer Inhibitoren von DNMTs sind die aufwendigen Assays, die traditionell zur Untersuchung der DNMT-Aktivität verwendet^{werden 28}. Assays sind in der Regel diskontinuierlich mit mehreren Schritten. Die enzymatische Aktivität von DNMTs wird immer noch routinemäßig mit radioaktivem S-Adenosylmethionin (SAM) ^{29,30,31,32,33,34} untersucht. Nicht-radioaktive Assays für die DNA-Methylierung wurden ebenfalls entwickelt. Zum Beispiel wurden Assays beschrieben, die methylsensitive Restriktionsendonukleasen und Elektrophorese zur Trennung der Verdauungsprodukte verwenden^35,36. Diese Arten von diskontinuierlichen, mehrstufigen Assays sind für die Wirkstoffforschung nicht ohne weiteres zugänglich. Seit Mitte der 2000er Jahre wurden mehrere DNA-Methylierungsassays mit höherem Durchsatz entwickelt²⁸. Ein Szintillations-Proximity-Assay wurde verwendet, um nach DNMT1-Inhibitoren zu suchen³⁷. Ein weiterer Assay unter Verwendung einer methylsensitiven Restriktionsendonuklease wurde verwendet, um nach DNMT3a-Inhibitoren^25,38 zu suchen. Während beide Assays einen höheren Durchsatz als herkömmliche DNA-Methylierungsassays ermöglichten, erfordern die Assays mehrere Schritte und erlauben nicht die Beobachtung der Methylierungsaktivität in Echtzeit. In jüngerer Zeit wurde ein kontinuierlicher Kinetik beschrieben, der die Bildung von S-Adenosylhomocystein (SAH), einem Produkt der Methylierungsreaktion, an die spektroskopische Veränderung bei 340 nm koppelt, die mit der NADPH-Oxidation³⁹ assoziiert ist. Dieser Assay verwendet drei Kopplungsenzyme, um ein spektroskopisches Signal zu erzeugen.

Wir entwickelten einen fluoreszenzbasierten Endonuklease-gekoppelten DNA-Methylierungsassay, der ein einzelnes kommerziell verfügbares Kopplungsenzym verwendet und Daten in Echtzeit generieren kann (Abbildung 1). Als Substrat wird ein Haarnadel-Oligonukleotid verwendet, das drei Methylcytosine enthält. Die Substrat-DNA enthält einen Fluorophor am 5′-Ende und einen Quencher am 3′-Ende. Die Methylierung der hemimethylierten CpG-Stelle erzeugt die Spaltstelle für die Endonuklease Gla I – vollständig methyliertes GCGC. Die Gla-I-Spaltung des Produktoligonukleotids setzt den Fluorophor aus dem Quencher frei und erzeugt Fluoreszenz in Echtzeit. Der Assay kann verwendet werden, um die Aktivität jeder Isoform von DNMT zu untersuchen; jedoch wird eine höhere Aktivität mit DNMT1 beobachtet, da dieses Isoenzym bevorzugt hemimethylierte DNA ^1,5 methyliert. Eine noch robustere Aktivität wird beobachtet, wenn die autoinhibitorische RFTS-Domäne (Replication Foci Targeting Sequence) aus DNMT1 entfernt wird. Diese Domäne, die sich in der N-terminalen regulatorischen Region befindet, bindet an die katalytische Stelle und verhindert die DNA-Bindung. Die Entfernung der ersten ~600 Aminosäuren führt zu einem verkürzten Enzym, das signifikant aktiver ist als das Enzym in voller Länge (~640-facher Anstieg in k_Katze / K_m)⁴⁰. Diese aktivierte Form des Enzyms, die als RFTS-fehlendes DNMT1 (Aminosäuren 621–1616) bezeichnet wird, ermöglicht aufgrund ihrer erhöhten katalytischen Kraft die leichtere Identifizierung von Inhibitoren. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, um RFTS-fehlendes DNMT1 in Assays zu verwenden, um nach potenziellen niedermolekularen Inhibitoren zu suchen. Mit dem Endonuklease-gekoppelten kontinuierlichen Assay wird die Anfangsgeschwindigkeit in Gegenwart und Abwesenheit einiger kleiner Moleküle bestimmt. Jeder potenzielle Inhibitor wird bei zwei Konzentrationen untersucht, um nach konzentrationsabhängiger DNMT1-Hemmung zu suchen. Die prozentuale Aktivität, die in Gegenwart der kleinen Moleküle beobachtet wurde, wurde jeweils berechnet.

Abbildung 1: DNA-Methylierungstest. Als Substrat wird eine hemimethylierte Haarnadel-DNA mit einem Fluorophor am 5′-Ende und einem Quencher am 3′-Ende verwendet. DNMT1 katalysiert den Transfer der Methylgruppe von S-Adenosylmethionin zur nicht methylierten CpG-Stelle und erzeugt S-Adenosylhomocystein und vollständig methylierte DNA. Das DNA-Produkt enthält die Spaltstelle für die Endonuklease Gla I, die vollständig methylierte GCGC-Stellen spaltet. Die Spaltung der Produkt-DNA setzt den 5′-Fluorophor aus dem 3′-Quencher frei und erzeugt Fluoreszenz. Abkürzungen: Fl = Fluorophor; Q =Quencher; DNMT1 = DNA-Methyltransferase 1; SAM = S-Adenosylmethionin; SAH = S-Adenosylhomocystein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

1. Bereiten Sie Assay-Lösungen für den Bildschirm vor HINWEIS: Die Konzentrationen der in diesem Assay verwendeten Substrate können angepasst werden. Für RFTS-fehlendes DNMT1 betragen die experimentell ermitteltenK-m-Werte für das Haarnadel-DNA-Substrat und SAM 1–2 nM bzw. 2 μM bzw.26,40. Bereiten Sie 600 μL jeder Testbedingung vor, die in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis getestet wird.<b…

Representative Results

Aktives DNMT1 ist Voraussetzung für diese Analyse. RFTS-fehlendes DNMT1 wurde in E. coli exprimiert und nach zuvor veröffentlichten Verfahren41 auf Homogenität gereinigt. Um sicherzustellen, dass das gereinigte Enzym aktiv war, wurde ein diskontinuierlicher Endonuklease-gekoppelter Assay verwendet, um die DNA-Methylierungsaktivität36 zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine 32-Basenpaar-Duplex-DNA mit einem einzelnen hemimethylierten CpG, das in einer Sau3A1…

Discussion

Um Inhibitoren von DNA-Methyltransferasen zu identifizieren und zu charakterisieren, muss die Aktivität des Enzyms gemessen werden. Es gibt mehrere Methoden zur Untersuchung der DNA-Methyltransferase-Aktivität. Die Aktivität wird üblicherweise mit Radioaktivität überwacht; Der Transfer der markierten Methylgruppe von SAM kann quantifiziert werden 29,30,31,32,33,34.<sup class="x…

Materials

96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates	ThermoFisher	249570
Bovine Serum Albumin	NEB	B9000S
compound 1	ChemBridge	5812086	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2	ChemBridge	6722175	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3	ChemBridge	5249376	screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol	Sigma	D0632
Gla I	SibEnzyme	E494	methyl-sensitive endonuclease
Glycerol	RPI	G22025
Magnesium Chloride	Sigma	M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)	IDT	custom synthesized	internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate	Sigma	G1501
S-adenosylmethionine	Sigma	A4377	methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base	RPI	T60040