Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model
Summary
De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.
Abstract
Arteriogenese is sterk afhankelijk van leukocyten- en bloedplaatjesrekrutering naar de perivasculaire ruimte van groeiende collaterale vaten. De standaardbenadering voor het analyseren van collaterale slagaders en leukocyten in arteriogenese is ex vivo (immuno-) histologische methodologie. Deze techniek maakt het echter niet mogelijk om dynamische processen zoals bloedstroom, schuifspanning, cel-celinteracties en deeltjessnelheid te meten. Dit artikel presenteert een protocol om in vivo processen in groeiende collaterale slagaders tijdens arteriogenese te monitoren met behulp van intravitale beeldvorming. De hier beschreven methode is een betrouwbaar hulpmiddel voor dynamische meting en biedt een analyse met hoog contrast met minimale fotocytotoxiciteit, geleverd door multifoton excitatiemicroscopie. Voorafgaand aan het analyseren van groeiende collaterale slagaders, werd arteriogenese geïnduceerd in de adductorspier van muizen door unilaterale ligatie van de dijbeenslagader.
Na de ligatie begonnen de reeds bestaande collaterale slagaders te groeien als gevolg van verhoogde schuifspanning. Vierentwintig uur na de operatie werden de huid en het onderhuidse vet boven de collaterale slagaders verwijderd, waardoor een zak werd geconstrueerd voor verdere analyses. Om de bloedstroom en immuuncellen tijdens in vivo beeldvorming te visualiseren, werden CD41-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (bloedplaatjes) en CD45-fycoerythrine (PE) (leukocyten) antilichamen intraveneus (i.v.) geïnjecteerd via een katheter die in de staartader van een muis werd geplaatst. Dit artikel introduceert intravitale multifotonenbeeldvorming als alternatief of in vivo complementatie voor de veelgebruikte statische ex vivo (immuno-) histologische analyses om processen te bestuderen die relevant zijn voor arteriogenese. Samenvattend beschrijft dit artikel een nieuwe en dynamische in vivo methode om immuuncelhandel, bloedstroom en schuifspanning te onderzoeken in een achterledigmodel van arteriogenese, wat de evaluatiemogelijkheden aanzienlijk verbetert.
Introduction
Ondanks intensieve onderzoeksinteresse in de afgelopen jaren, zijn hart- en vaatziekten, bijvoorbeeld ischemische hartziekten en beroertes, nog steeds de belangrijkste wereldwijde doodsoorzaak1. Huidige behandelingen voor deze ziekten zijn zeer invasieve therapieën zoals percutane transluminale angioplastiek, percutane transluminale coronaire angioplastiek of bypass-chirurgie2. Daarom is de ontwikkeling van alternatieve, niet-invasieve therapeutische opties dringend nodig. Het lichaam kan natuurlijke bypasses rond een gestenoseerd of afgesloten vat creëren om de onderbroken bloedtoevoer naar het distale deel van de stenose om te leiden. Dit proces wordt arteriogenese2 genoemd. Veel recente studies hebben aangetoond dat verhoogde vloeistofafschuiving invloed heeft op de rekrutering van leukocyten, die een belangrijke rol speelt tijdens arteriogenese3. De belangrijkste huidige opties om de rekrutering van leukocyten tijdens arteriogenese te analyseren zijn ex vivo (immuno-) histologische analyses of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) methodologie4. Om de beoordeling van leukocytendynamiek tijdens arteriogenese mogelijk te maken, presenteert dit artikel een intravitaal beeldvormingsprotocol met multifotonenmicroscopie.
Leukocyten zijn de belangrijkste bloedcellen die worden gerekruteerd tijdens het proces van arteriogenese3. Dit protocol maakt gebruik van multifotonenbeeldvorming om het kruipen van adherente leukocyten gelabeld met geïnjecteerde anti-CD45-PE-antilichamen in collaterale slagaders aan te tonen, 24 uur na de inductie van arteriogenese door femorale arterieligatie (FAL) met behulp van een muizenachtermaat ischemiemodel 5,6. Als alternatief kunnen immuuncellen ex vivo worden gelabeld en zorgvuldig in muizen worden geïnjecteerd, zoals blijkt uit onderzoeken naar angiogenese met behulp van intravitale microscopie7. De bloedstroom in bloedvaten en slagaders kan worden gevisualiseerd door CD41-FITC (om bloedplaatjes te labelen), dextran-FITC (plasma) of door de tweede harmonische generatie (SHG), die collageen type 1 visualiseert dat aanwezig is in het keldermembraan van een deel van de vaatboom. SHG is een uniek gratis labelend effect van de multifoton excitatie. Multifotonbeeldvorming maakt langdurige celtracking mogelijk zonder het weefsel te beschadigen en de cellen te activeren door laservermogensexcitatie. Multifotonenmicroscopie is de beeldvormingsmethode bij uitstek voor het visualiseren van fluorescerend gelabelde cellen en structuren in levende dieren vanwege het vermogen om de fluoroforen dieper in het weefsel / organen te exciteren met minimale fototoxiciteit8.
Het gebruik van afgestemde infraroodlasers met pulsen die binnen femtoseconde-intervallen worden afgeleverd, prikkelt het fluorochroom alleen bij het brandpuntsvlak, zonder excitatie boven en onder het brandpuntsvlak8. Multifotonenmicroscopie maakt dus een hoge spatio-temporele resolutie, minder fotoschade en verhoogde weefselpenetratiebeeldvorming mogelijk voor het bestuderen van dynamische biologische gebeurtenissen in de organen. Het is een ideaal microscopie-instrument voor beeldvorming van levende dieren. Multifoton en elke andere kunst van intravitale microscopie wordt echter beperkt door weefselbeweging als gevolg van hartslag, ademhaling, peristaltische bewegingen, spiertonaliteit en andere fysiologische functies, die de verwerving en analyse van beeldvorming verstoren. Aangezien deze bewegingen de temporele en ruimtelijke resolutie aantasten en soms zelfs latere analyse verbieden, moeten ze op de juiste manier worden aangepakt om nauwkeurige gegevensanalyse en -interpretatie mogelijk te maken. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om artefacten van weefselbeweging te verlagen of te voorkomen. Dit protocol past een in situ driftcorrectiesoftware genaamd VivoFollow9 toe om weefseldrift tijdens beeldacquisitie te corrigeren. Deze aanpak biedt de vereiste beeldstabilisatie, waardoor beeldvorming op lange termijn en celtraceringsanalyse mogelijk zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven methode van multifoton in vivo analyse van leukocytenrekrutering vormt een aanvulling op veelgebruikte hulpmiddelen voor leukocytenrekruteringsstudies zoals (immuno-) histologische of FACS-analyses. Met deze beeldvormingsmethode is het mogelijk om de dynamische processen in leukocytenaanhechting en extravasatie tijdens arteriogenese in meer detail te visualiseren10. Ondanks de toegevoegde waarde van deze methode, bevat het aangeboden protocol enkele kritieke stappen en beper…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, project Z01). Wij danken Dr. Susanne Stutte voor het lezen van het manuscript.
Materials
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (0/7) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020)
- Deindl, E., Schaper, W. The art of arteriogenesis. Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques–FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
