Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell
Summary
Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.
Abstract
Die Arteriogenese hängt stark von der Rekrutierung von Leukozyten und Thrombozyten in den perivaskulären Raum wachsender Kollateralgefäße ab. Der Standardansatz für die Analyse von Kollateralarterien und Leukozyten in der Arteriogenese ist die ex vivo (immun-)histologische Methodik. Diese Technik erlaubt jedoch nicht die Messung dynamischer Prozesse wie Blutfluss, Scherspannung, Zell-Zell-Wechselwirkungen und Partikelgeschwindigkeit. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Überwachung von In-vivo-Prozessen in wachsenden Kollateralarterien während der Arteriogenese unter Verwendung intravitaler Bildgebung vorgestellt. Die hier beschriebene Methode ist ein zuverlässiges Werkzeug zur Dynamikmessung und bietet eine kontrastreiche Analyse mit minimaler Photozytotoxizität, die durch Multiphotonen-Anregungsmikroskopie ermöglicht wird. Vor der Analyse wachsender Kollateralarterien wurde die Arteriogenese im Adduktorenmuskel von Mäusen durch einseitige Ligatur der Oberschenkelarterie induziert.
Nach der Ligatur begannen die bereits vorhandenen Kollateralarterien aufgrund der erhöhten Scherspannung zu wachsen. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation wurden die Haut und das Unterhautfett über den Seitenarterien entfernt, wodurch eine Tasche für weitere Analysen entstand. Um den Blutfluss und die Immunzellen während der In-vivo-Bildgebung sichtbar zu machen, wurden CD41-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (Thrombozyten) und CD45-Phycoerythrin (PE) (Leukozyten) Antikörper intravenös (i.v.) über einen Katheter injiziert, der in die Schwanzvene einer Maus gelegt wird. In diesem Artikel wird die intravitale Multiphotonenbildgebung als Alternative oder in vivo Ergänzung zu den häufig verwendeten statischen ex vivo (immun-) histologischen Analysen zur Untersuchung von Prozessen vorgestellt, die für die Arteriogenese relevant sind. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine neuartige und dynamische in vivo Methode zur Untersuchung des Immunzelltransports, des Blutflusses und der Scherbelastung in einem Hintergliedmaßenmodell der Arteriogenese, was die Evaluierungsmöglichkeiten erheblich verbessert.
Introduction
Trotz intensivem Forschungsinteresse in den letzten Jahren sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen, z. B. ischämische Herzkrankheit und Schlaganfall, nach wie vor die weltweit häufigste Todesursache1. Gegenwärtig werden diese Erkrankungen mit hochinvasiven Therapien wie der perkutanen transluminalen Angioplastie, der perkutanen transluminalen Koronarangioplastie oder der Bypass-Operationbehandelt 2. Daher ist die Entwicklung alternativer, nicht-invasiver Therapieoptionen dringend erforderlich. Der Körper kann natürliche Bypässe um ein verstumpftes oder verschlossenes Gefäß herum anlegen, um den unterbrochenen Blutfluss in den distalen Teil der Stenose umzuleiten. Dieser Prozess wird als Arteriogenese2 bezeichnet. Viele neuere Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte Flüssigkeitsscherung die Rekrutierung von Leukozyten beeinflusst, die eine wichtige Rolle bei der Arteriogenesespielt 3. Die wichtigsten aktuellen Optionen zur Analyse der Rekrutierung von Leukozyten während der Arteriogenese sind ex vivo (immun-)histologische Analysen oder die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)4. Um die Leukozytendynamik während der Arteriogenese beurteilen zu können, wird in dieser Arbeit ein intravitales Bildgebungsprotokoll mit Multiphotonenmikroskopie vorgestellt.
Leukozyten sind die wichtigsten Blutzellen, die während des Prozesses der Arteriogenese rekrutiertwerden 3. Dieses Protokoll verwendet Multiphotonen-Bildgebung, um das Kriechen von adhärenten Leukozyten, die mit injizierten Anti-CD45-PE-Antikörpern markiert waren, in Kollateralarterien 24 h nach der Induktion der Arteriogenese durch Femoralarterienligatur (FAL) unter Verwendung eines murinen Hintergliedmaßen-Ischämiemodells zu zeigen 5,6. Alternativ können Immunzellen ex vivo markiert und Mäusen schonend injiziert werden, wie Studien zur Angiogenese mittels Intravitalmikroskopiegezeigt haben 7. Der Blutfluss in Gefäßen und Arterien kann durch CD41-FITC (zur Markierung von Blutplättchen), Dextran-FITC (Plasma) oder durch die zweite harmonische Generation (SHG) visualisiert werden, die Kollagen Typ 1 in der Basalmembran eines Teils des Gefäßbaums sichtbar macht. SHG ist ein einzigartiger freier Markierungseffekt der Multiphotonenanregung. Die Multiphotonen-Bildgebung ermöglicht eine langfristige Zellverfolgung, ohne das Gewebe zu schädigen und die Zellen durch Anregung mit Laserleistung zu aktivieren. Die Multiphotonenmikroskopie ist die Bildgebungsmethode der Wahl für die Visualisierung fluoreszenzmarkierter Zellen und Strukturen in lebenden Tieren, da sie die Fluorophore mit minimaler Phototoxizität tiefer in das Gewebe/die Organe anregen kann8.
Die Verwendung von abgestimmten Infrarotlasern mit Pulsen, die in Femtosekundenintervallen abgegeben werden, regt das Fluorochrom nur in der Brennebene an, ohne Anregung oberhalb und unterhalb der Brennebene8. Somit ermöglicht die Multiphotonenmikroskopie eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung, weniger Lichtschäden und eine erhöhte Gewebedurchdringungsbildgebung zur Untersuchung dynamischer biologischer Ereignisse in den Organen. Es ist ein ideales Mikroskopiewerkzeug für die Bildgebung lebender Tiere. Multiphotonen und jede andere Kunst der intravitalen Mikroskopie sind jedoch durch Gewebebewegungen aufgrund von Herzschlag, Atmung, peristaltischen Bewegungen, Muskeltonalität und anderen physiologischen Funktionen begrenzt, was die Bildaufnahme und -analyse stört. Da diese Bewegungen die zeitliche und räumliche Auflösung beeinträchtigen und manchmal sogar eine nachträgliche Analyse verhindern, müssen sie angemessen berücksichtigt werden, um eine genaue Datenanalyse und -interpretation zu ermöglichen. Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, um Artefakte durch Gewebebewegungen zu verringern oder zu verhindern. Dieses Protokoll wendet eine In-situ-Driftkorrektursoftware namens VivoFollow9 an, um die Gewebedrift während der Bildaufnahme zu korrigieren. Dieser Ansatz bietet die erforderliche Bildstabilisierung und ermöglicht eine Langzeitbildgebung und Zellverfolgungsanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebene Methode der Multiphotonen-in-vivo-Analyse der Leukozytenrekrutierung stellt eine Ergänzung zu den üblicherweise verwendeten Werkzeugen für Leukozytenrekrutierungsstudien wie (immun-)histologische oder FACS-Analysen dar. Mit diesem bildgebenden Verfahren ist es möglich, die dynamischen Prozesse der Leukozytenadhärenz und -extravasation während der Arteriogenese detaillierter darzustellen10. Trotz des Mehrwerts dieser Methode enthält das angebotene Protokoll einige k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde vom SFB 914 der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (HI-A/SM, Projekt Z01). Wir danken Dr. Susanne Stutte für die Lektüre des Manuskripts.
Materials
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (0/7) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
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- Deindl, E., Schaper, W. The art of arteriogenesis. Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).
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