Ein Explantationssystem für Zeitraffer-Bildgebungsstudien der olfaktorischen Schaltkreismontage bei Drosophila

Summary

Dieses Protokoll beschreibt das Dissektionsverfahren, den Kulturzustand und die Live-Bildgebung eines Antennen-Hirn-Explantationssystems zur Untersuchung der olfaktorischen Schaltkreisanordnung.

Abstract

~ Neuronen sind präzise miteinander verbunden, um Schaltkreise zu bilden, die für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns unerlässlich sind. Das Drosophila-Geruchssystem bietet ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen, da 50 Arten von olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORNs) aus den Antennen und Oberkieferpalpen ihre Axone auf 50 identifizierbare Glomeruli im Antennenlappen projizieren und synaptische Verbindungen mit Dendriten aus 50 Arten von Projektionsneuronen zweiter Ordnung (PNs) bilden. Frühere Studien konzentrierten sich hauptsächlich auf die Identifizierung wichtiger Moleküle, die das präzise Targeting im Riechkreislauf mit festem Gewebe regulieren. Hier wird ein Antennen-Hirn-Explantationssystem beschrieben, das wichtige Entwicklungsmeilensteine der olfaktorischen Schaltkreismontage in Kultur rekapituliert. Durch das Sezieren der äußeren Kutikula und die Reinigung undurchsichtiger Fettkörper, die das sich entwickelnde Puppengehirn bedecken, können mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder einzelner Neuronen aus lebenden Gehirnen gesammelt werden. Dies ermöglicht die Zeitraffer-Bildgebung einzelner ORN-Axon-Targeting aus lebendem Gewebe. Dieser Ansatz wird dazu beitragen, wichtige zellbiologische Kontexte und Funktionen zuvor identifizierter wichtiger Gene aufzudecken und Mechanismen zu identifizieren, die dem dynamischen Prozess der Schaltungsmontage zugrunde liegen.

Introduction

Neuronen sind präzise miteinander verbunden, um Schaltkreise zu bilden, die für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns unerlässlich sind. Seit über 100 Jahren versuchen Neurowissenschaftler zu verstehen, wie sich Neuriten mit extremer Präzision auf ihre Zwischen- und Endziele ausdehnen. Infolgedessen haben sie wichtige Gene identifiziert, die Leitfäden für die Entwicklung neuronaler Prozesse^{kodieren 1}. Das olfaktorische System von Drosophila bietet ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen, da olfaktorische Rezeptorneuronen (ORNs, die primären sensorischen Neuronen) auf 50 identifizierbare Glomeruli mit stereotyper Größe, Form und relativer Position projizieren, wo sie synaptische Verbindungen mit Dendriten aus 50 Arten von Projektionsneuronen zweiter Ordnung (PNs) bilden, von denen jeder Dendriten an einen der 50 Glomeruli² sendet (Abbildung 1A ). Daher ist es relativ einfach, mutierte Phänotypen bei synaptischer (glomerulärer) Auflösung im olfaktorischen Fliegensystem zu identifizieren. Dies führte zur Entdeckung wichtiger Gene, die die olfaktorische Schaltkreismontage^{regulieren 3}.

Der Aufbau des olfaktorischen Flugkreislaufs beruht auf zeitlich und räumlich koordinierten Entwicklungsprozessen³. ORNs und PNs erwerben unterschiedliche Zellschicksale, die das Programm für ihre Verdrahtungsspezifika einrichten. Als nächstes mustern PN-Dendriten den Antennenlappen vor (Abbildung 1B). Die Axone von ORNs umrunden dann den ipsilateralen Antennenlappen und überqueren die Mittellinie des Gehirns, um den kontralateralen Antennenlappen zu erreichen. Anschließend dringen ORN-Axone sowohl in ipsi- als auch in kontralaterale Antennenlappen ein und bilden Synapsen mit Dendriten ihrer Partner-PNs in spezifischen Glomeruli. Dieses grobe Modell für die olfaktorische Schaltungsmontage wurde auf der Grundlage der Charakterisierung fester Proben aus Zwischenzeitpunkten während der Entwicklung vorgeschlagen. Die schlechte zeitliche Auflösung und die Unfähigkeit, den gleichen neuronalen Prozessen während der gesamten Entwicklung aus festem Gewebe zu folgen, schränken das mechanistische Verständnis des Schaltkreismontageprozesses ein.

Es ist technisch schwierig, ORN- und PN-Prozesse in vivo live abzubilden, da der Verdrahtungsprozess in der ersten Hälfte des Puppenstadiums stattfindet, wenn der Antennenlappen von einem undurchsichtigen Fettkörper im Puppengehäuse umgeben ist. Es ist daher unmöglich, den sich entwickelnden olfaktorischen Kreislauf direkt von intakten Puppen abzubilden. Ex-vivo kultiviertes seziertes Gewebe kann die Opazität des Gewebes umgehen und wurde erfolgreich zur Untersuchung der neuronalen Entwicklung^eingesetzt 4,5,6. Die Herausforderung bei der Verwendung einer ähnlichen Ex-vivo-Explantationskulturstrategie zur Untersuchung der neuronalen Verdrahtung im Puppengehirn besteht darin, ob sie das genaue Neuronen-Targeting in einem Kulturzustand rekapituliert. Basierend auf einer zuvor berichteten Ex-vivo-Kulturbedingung für den Fliegenaugehirn-Komplex⁷ wurde kürzlich ein Explantat entwickelt, das das gesamte Puppengehirn, die Antennen und die verbindenden Antennennerven intakt enthält, das eine präzise Ausrichtung des olfaktorischen Schaltkreises beibehält und einer Zwei-Photonen-Mikroskopie-basierten Live-Bildgebung für bis zu 24 h mit einer Frequenz von jeweils 20 min^{unterzogen werden kann 8} . Hier wird ein detailliertes Protokoll der Explantierkultur und Bildgebung beschrieben. Das Explant-System bietet eine leistungsstarke Methode, um den Aufbau des olfaktorischen Schaltkreises und möglicherweise anderer Schaltkreise im zentralen Gehirn zu untersuchen.

Protocol

1. Herstellung von Reagenzien HINWEIS: Alle Schritte in diesem Protokoll werden bei Raumtemperatur (20-25 °C) durchgeführt, sofern nicht anders erklärt. Um die Kulturschale für die Immobilisierung des Explantats während der Zeitrafferbildgebung vorzubereiten, legen Sie 0,5 cm dickes Sylgard (vor Gebrauch zwei flüssige Komponenten im Verhältnis 10:1 gründlich mischen) auf die Unterseite einer 60 mm x 15 mm großen Petrischale und lassen Sie es bei Raumtemperat…

Representative Results

ORN-Axone kommen zwischen 18 h und 36 h APF am Antennenlappen an. Sie navigieren dann durch den Antennenlappen, überqueren die Mittellinie und innervieren die Glomeruli. Video 1 ist ein repräsentatives Video , das den gesamten Prozess für mehrere einzeln identifizierbare Axone zeigt, aufgenommen mit einer Frequenz von 20 Minuten für 24 Stunden. Vor der Registrierung mit TurboReg zeigen die Axone eine gewisse seitliche Drift, wenn sich das Gehirn entwickelt (erste Hälfte des Videos). Nach der Registr…

Discussion

Das Drosophila-Antennen-Hirn-Explantat behält das normale Targeting des olfaktorischen Schaltkreises bei. Wir haben festgestellt, dass die Entwicklung ex vivo im Vergleich zu in vivo 2-mal langsamer ist. Es wird darauf hingewiesen, dass das Explantationssystem den Oberkieferpalp, der sechs Arten von ORNs beherbergt, nicht beibehält. Um sicherzustellen, dass die normale Entwicklung ex vivo rekapituliert wird, muss eine Dehnung der Antennennerven während der Explantissektion vermiede…

Materials

20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000