Summary
Здесь мы описываем метод визуализации и количественной оценки сосудов задних конечностей мышей с использованием микро-рентгеновской компьютерной томографии.
Abstract
Кровеносные сосуды представляют собой сложные сети с древовидными структурами, а сосудистые сети необходимы для поддержания как кровообращения, так и поддержания функции органа. Поэтому выяснение механизма образования кровеносных сосудов чрезвычайно полезно для выяснения процессов развития и патологических механизмов. Мышиные сосуды задних конечностей часто используются в качестве модели физиологического и патологического ангиогенеза. Оценка в основном выполняется двумерным методом с использованием тканевых срезов. Однако методы оценки трехмерной (3D) морфологии сосудов особенно ограничены. В данной работе представлен метод визуализации задних конечностей мышей с помощью компьютерной томографии (КТ). Радиационно-непрозрачная смола вводится через нисходящую аорту, а целые сосуды заполняются красителем. Регулируя время инъекции красителя, также возможно артериально-специфическое заполнение, и образцы могут быть получены с помощью любого микро-рентгеновского КТ-устройства. Этот контрастный метод обеспечивает базовую технику для 3D-оценки мышиных кровеносных сосудов в нижних конечностях. Кроме того, этот метод может быть использован для визуализации всех кровеносных сосудов ниже диафрагмы и оценки кровеносных сосудов в органах брюшной полости.
Introduction
Кровеносные сосуды представляют собой сложные сети с древовидными структурами. Ангиогенез и новое сосудистое образование играют важную роль в поддержании гомеостаза органа1. Ангиогенез регулируется для лечения ишемических и злокачественных заболеваний2. Поэтому важно понять основные механизмы ангиогенеза. Мышиные сосуды задних конечностей часто используются в качестве полезной модели для сосудистых исследований3; ипсилатеральная перевязка подвздошной или бедренной артерии является известной моделью ишемии задних конечностей, используемой для оценки ангиогенеза и ремоделирования сосудов в физиологическом и патологическом ангиогенезе4. Однако оценка ангиогенеза в основном выполняется окрашиванием сечения, а методы оценки 3D-морфологии сосудов особенно ограничены.
По сравнению с окрашиванием секций, КТ обеспечивает 3D-визуализацию. Недавно Weyers et al. сообщили о сложном протоколе, подходящем для КТ-визуализации, позволяющем визуализировать систему коронарного кровообращения у взрослых мышей5. Мы модифицировали их метод, чтобы создать метод пробоподготовки, подходящий для компьютерной томографии кровеносных сосудов нижних конечностей6. Здесь через нисходящую аорту вводится радиационно-непрозрачная смола, а сосуды в нижних конечностях заполняются красителем. Регулируя время инъекции красителя, также возможно артериально-специфическое заполнение, и образцы могут быть получены с помощью любого микро-рентгеновского компьютерного томографического устройства. Этот контрастный метод обеспечивает базовую технику для 3D-оценки мышиных кровеносных сосудов ниже диафрагмы и в органах брюшной полости и нижних конечностях.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными Университета Кумамото (ссылка на одобрение No. M30-040/A2020-105), которые соответствуют Руководству Национальных институтов здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных (публикация No 85-23, пересмотрена в 2011 году).
1. Подготовка
- Готовят перфузионный аппарат и сосудорасширяющий буфер (4 мг/л папаверина гидрохлорида, 4 г/л; аденозин, 1 г/л; гепарин, 1 Ед/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлюксное устройство и сосудорасширяющие реагенты такие же, как и те, о которых сообщает Weyers et al.5. - Подключите катетер 22 G, удлинительную трубку 2 мл и трехсторонний запорный кран (рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте датчик в соответствии с размером животного. Для взрослых мышей C57BL/6 оптимально 22 г. - Заполните перфузионный аппарат давлением сосудорасширяющим буфером (рисунок 1А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков, чтобы предотвратить нарушение наполнения контрастного вещества.
2. Перфузия
- Вводят 1 ЕД/г гепарина в ПБС во внутрибрюшинную полость за 30 мин до операции.
- Полностью обезболить мышь изофлураном и усыпить ее путем вывиха шейки матки.
- После обезглавливания сделайте разрез средней линии в грудине и зафиксируйте открытую грудную клетку штифтами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать утечки контраста, избегайте повреждения диафрагмы. - Отрежьте восходящую аорту и удалите сердце.
- Удалить легкое и обнажить нисходящую аорту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не повреждайте нисходящую аорту. - Вырежьте нисходящую аорту по диагонали, чтобы обнажить поперечное сечение (рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не отслаивайте аорту; диагональный срез лучше подходит для введения катетера. - Вставьте катетер 22 G в нисходящую аорту во время работы буфера вазодилатации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка катетера во время работы сосудорасширяющего буфера позволяет избежать загрязнения воздуха. - Закрепите корень катетера (рисунок 1С).
- Сделайте узел, чтобы предотвратить утечку из-за обратного потока.
- Дозируйте подогретый сосудорасширяющий раствор (папаверина гидрохлорид, 4 г/л; аденозин, 1 г/л; гепарин, 1 ЕД/мл) в течение 3 мин при фиксированном давлении от 13 до 15 кПа.
- Перфузировать раствором 4% параформальдегида (PBS) в течение 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешность фиксации может быть подтверждена движением стопы (рисунок 1D). - Подготовьте контрастное вещество непосредственно перед перфузией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте скорость разрежения в соответствии с образцом; для взрослых мышей смешайте пятно и разбавитель в соотношении 1:1. - Остановите перфузию и заполните удлинительную трубку 2 мл разбавленного контрастного вещества (рисунок 1Е).
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрастное вещество следует вводить медленно, чтобы избежать повреждения кровеносных сосудов. - Перфьминируйте контрастное вещество при фиксированном давлении от 13 до 15 кПа.
- Чтобы визуализировать артерии, проверьте ноготь на ноге, чтобы подтвердить, что контрастное вещество достигло артерии (рисунок 1F).
- Чтобы визуализировать все сосуды, проверьте нижнюю полую вену диафрагмы, чтобы подтвердить полную циркуляцию контрастного вещества.
ПРИМЕЧАНИЕ: В начале контраст содержит сосудорасширяющий раствор; следовательно, его правильная циркуляция имеет важное значение.
- Закройте трехсторонний запорный кран и снимите трубку (рисунок 1G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если трехсторонний запорный кран не закрыт, контраст будет течь в обратном направлении. - Инкубируйте образец в течение ночи при 4 °C.
- Удалите кожу и зафиксируйте ее в 10% растворе формальдегида.
3. Визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы визуализации различаются в зависимости от КТ-сканера. В этом протоколе использовался микрофокусный рентгеновский компьютерный томограф. Необходимо оптимизировать метод визуализации в соответствии с каждым компьютерным томографом.
- Зафиксируйте образец в пробирке объемом 50 мл, содержащей PBS.
- Положите пробирку на стол.
- Отсканируйте образец напряжением 50 кВ и током 600 мкА, обеспечив расстояние фокусировки до центра 75,2 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер 1 вокселя составлял 28,7 мкм x 28,7 мкм x 28,7 мкм в этом значении. - Загрузите полученные данные изображений с Фиджи, платформы с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений.
- Определите значение вокселя мышц с помощью икроножной мышцы.
- Выберите икроножную мышцу с помощью инструмента «Прямоугольник ».
- Проверьте среднее и стандартное отклонение (SD) от гистограммы (Анализ | Гистограмма).
- Определите плотность мышечного вокселя как среднюю + 2SD икроножной мышцы.
- Установите плотность мышечного вокселя в качестве нижнего порогового уровня (Image | отрегулируйте | Пороговое | Набор | более низкий пороговый уровень).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистая область и область кости остаются в бинаризированных данных после установки порога.
Representative Results
Все сосуды в нижних конечностях могут быть визуализированы, если этот протокол выполнен правильно (рисунок 2A). В модели ишемии задних конечностей нелигированная бедренная артерия проходит параллельно бедренной вене (рисунок 2B), а перевязанная бедренная артерия может быть подтверждена прерыванием контрастных сред (рисунок 2C). Результаты выявили развитие коллатеральных сосудов (рисунок 2D). Коллатеральное кровообращение образуется между артериями, близкими к перевязанной артерии и артерией в области голени и на вентральной и дорсальной сторонах бедренной артерии. Нижняя ягодичная артерия, начинающаяся на дорсальной стороне таза и проходящая на боковой стороне бедра, уверенно расширяется на ишемической стороне.
Контрастно заполненные сосуды заполняются контрастным веществом (рисунок 2Е); нарушение контраста указывает на смешивание неконтрастных сред (например, крови, сосудорасширяющего буфера или пузырьков) или недостаточную перфузию контраста (рисунок 2F). Вазодилатация и фиксация не будут работать хорошо, если кровеносные сосуды сократились. Хотя компьютерная томография может визуализировать только контрастное вещество, можно просматривать артерии на поверхности тела с помощью макроскопического или стереомикроскопического наблюдения (рисунок 2G). Таким образом, легче оценить дефекты с помощью контрастного вещества (рисунок 2H).
Рисунок 1: Схема процедуры. (А) Аппарат перфузии под давлением и катетер 22 Г соединены через удлинительную трубку 2 мл и трехсторонний запорный кран. (B) Восходящая аорта разрезается по диагонали, чтобы обнажить поперечное сечение (желтая стрелка). (C) Катетер фиксировался с помощью двух штифтов (желтые стрелки). (D) Фиксированные нижние конечности выдвигаются при фиксации (желтые стрелки). (E) Введение контраста через трехсторонний запорный кран. Направление инъекции обозначено желтой стрелкой. (F) Ноготь задних конечностей заполнен контрастом (желтая стрелка). (G) Запорный кран закрывается и удаляется из перфузионного аппарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображения сосудов. (A) Целое изображение костей и сосудов задних конечностей. (B) Бедренная артерия (красная стрелка) и вена (синяя стрелка). (C) Перевязанная бедренная артерия (желтая стрелка). Периферия прерывается обструкцией (желтая пунктирная линия). (D) Коллатеральные сосуды в лигированной стороне (желтые стрелки). Желтая пунктирная линия представляет собой прерванную бедренную артерию. (E) Хорошо заполненный образец подкожной артерии (красная стрелка) и вены (синяя стрелка). F) Недостаточная перфузия приводит к прерыванию подкожных сосудов (желтая пунктирная линия). G) стереомикроскопическое наблюдение за репрезентативной выборкой. Правая бедренная артерия (желтая стрелка) заполнена контрастным веществом. H) стереомикроскопическое наблюдение неисправного образца. Правой бедренной артерии (желтая стрелка) не хватает контрастного вещества. Шкала стержней = 1 мм (B-F), 2 мм (G, H), 10 мм (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
В этом отчете представлен сложный метод визуализации кровеносных сосудов в нижней части тела. В этом процессе есть несколько критических этапов: первый – это преперфузия перед инъекцией контрастного вещества. Если не удалить достаточное количество крови, контраст не заполнит систему. Кроме того, включение пузырьков воздуха нарушает наполнение контраста; таким образом, воздух в цепи должен быть полностью удален. Более того, поскольку контрастное вещество не затвердевает сразу после инъекции, образец не следует чрезмерно перемещать.
Этот метод полезен для оценки повышенного образования кровеносных сосудов и кровообращения, таких как коллатеральное кровообращение. И наоборот, в качестве ограничения трудно оценить суженные кровеносные сосуды, так как отличить стеноз от искусственного уменьшения контрастного вещества сложно. Кроме того, трудно оценить кровеносные сосуды в костях, так как разделение крови и кости затруднено.
Альтернативным методом 3D-визуализации является иммуноокрашивание. Используя технику очистки тканей, для 3D-визуализации доступно несколько методов7. Иммуноокрашивание является преимуществом, поскольку оно позволяет окрашивать специфические белки с использованием антител. В недавнем докладе ставится задача по визуализации всего тела на основе иммуноокрашивания8; однако визуализация на основе КТ не требует предварительной обработки тканей.
Этот метод позволяет визуализировать все сосуды ниже диафрагмы, включая органы брюшной полости. Ангиогенез в органах брюшной полости оказывает сильное влияние на поддержание гомеостаза и развитие заболеваний9,10. Поскольку этот протокол был оптимизирован для оценки сосудов нижних конечностей, орган-специфическое праймирование позволило бы визуализировать ангиогенез, связанный с любым фактором, таким как воспаление или опухоли.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Мы благодарим Ясуё Кимуру, Мэгуми Нагахиро и Саэко Токунагу за отличную техническую поддержку в экспериментах на животных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
