Ökaryotik Glikojen Metabolizmasının İncelenmesi için Spektrofotometrik Yöntemler

Summary

Glikojen metabolizmasının anahtar enzimlerinin aktivitesini ölçmek için teknikler, görünür aralıkta çalışan basit bir spektrofotometre kullanılarak sunulmaktadır.

Abstract

Glikojen glikozun bir depolama formu olarak, bakterilerden hayvanlara kadar çok çeşitli organizmalar tarafından sentezlenir. Molekül, α1,4 bağlantılı glikoz kalıntılarının doğrusal zincirlerini ve α1,6 bağlantılarının eklenmesiyle ortaya çıkan dalları içerir. Glikojen sentezinin ve bozunmasının nasıl düzenlendiğini ve glikojen karakteristik dallanmış yapısına nasıl ulaştığını anlamak, glikojen depolama enzimlerinin incelenmesini gerektirir. Bununla birlikte, bu enzim aktivitelerini incelemek için en yaygın olarak kullanılan yöntemler tipik olarak tüm araştırmacılar için mevcut olmayan reaktifleri veya teknikleri kullanır. Burada, teknik olarak basit, uygun maliyetli ve yine de glikojen depolamanın kontrolü hakkında değerli bilgiler sağlayabilen bir dizi prosedürü tartışıyoruz. Teknikler, 330 ila 800 nm aralığında çalışan bir spektrofotometreye erişim gerektirir ve kullanıcıların tek kullanımlık, plastik küvetler kullanacağı varsayılarak açıklanmaktadır. Bununla birlikte, prosedürler kolayca ölçeklenebilir ve bir mikroplaka okuyucuda kullanılmak üzere değiştirilebilir, bu da oldukça paralel analizlere izin verir.

Introduction

Glikojen doğada yaygın olarak dağılmıştır, bileşik bakterilerde, birçok protistte, mantarda ve hayvanda bulunur. Mikroorganizmalarda, besinler sınırlandığında glikojen hücre sağkalımı için önemlidir ve memeliler gibi daha yüksek organizmalarda, glikojen sentezi ve bozulması kan şekeri seviyelerini tamponlamaya hizmet eder ^1,2,3. Bu nedenle, glikojen metabolizmasının incelenmesi, mikrobiyoloji ve memeli fizyolojisi gibi çeşitli alanlar için önemlidir. Glikojen metabolizmasını anlamak, glikojen sentezinin (glikojen sentaz ve dallanma enzimi) ve glikojen yıkımının (glikojen fosforilaz ve dallanma enzimi) anahtar enzimlerinin incelenmesini gerektirir. Glikojen sentaz, fosforilaz, dallanma ve dallanma enzim aktivitelerinin altın standart tahlilleri radyoaktif izotoplar kullanır. Örneğin, glikojen sentaz genellikle durdurulmuş bir radyokimyasal tahlilde, glikozun UDP-[14 C] glikozdan (hayvan ve mantar enzimleri durumunda) veya ADP-[¹⁴C] glikozdan (bakteriyel enzimler durumunda) glikojen ^4,5’e dahil edilmesini takiben ölçülür. Benzer şekilde, glikojen fosforilaz, glikozun [¹⁴C] glikoz-1-fosfattan glikojen^6’ya dahil edilmesini takiben, glikojen sentezi yönünde ölçülür. Dallanma enzimi, bu enzimin [14 C] glikozun glukoz-1-fosfattan ^α1,4bağlantılı zincirlere glikojen fosforilaz⁷ ile dahil edilmesini uyarma kabiliyeti ölçülerek test edilir ve debranching enzim aktivitesi, enzimin [¹⁴C] glikozu glikojen^8’e dahil etme kabiliyeti izlenerek belirlenir. . Çok hassas olmakla birlikte, düşük enzim aktivitesi seviyelerine sahip ham hücre ekstraktlarında kullanımlarına izin verirken, radyoaktif substratlar pahalıdır ve radyoizotop kullanımına eşlik eden düzenleyici gerekliliklere tabidir. Bu engeller, bazı tahlillerin kullanımını birçok işçinin erişemeyeceği bir yere yerleştirmektedir. Bununla birlikte, uzun yıllar boyunca, bu enzimlerin ölçümüne yönelik etkileyici çeşitlilikte spektrofotometrik yaklaşımlar tanımlanmıştır. Genel olarak, bu yaklaşımlar nihayetinde NADH / NADPH’nin üretimini veya tüketimini veya glikojen ve iyot arasındaki renkli komplekslerin oluşumunu ölçmeye dayanır. Bu nedenle, basittirler ve sadece tungsten veya xenon flaş lambaları ile donatılmış basit spektrofotometreler kullanılarak gerçekleştirilebilirler.

Glikojen sentazın spektrofotometrik testleri, büyüyen glikojen zincirine glikoz eklendikçe şeker nükleotid donöründen salınan nükleozid difosfatın ölçülmesine dayanır ^9,10. Aşağıdaki protokolün 1. bölümünde açıklanan glikojen sentaz aktivitesini ölçme prosedürü, Wayllace ve ^ark.11 tarafından özetlenenlerin bir modifikasyonudur ve bağlantı şeması aşağıda gösterilmiştir:

(Glikoz) _n + UPD-glukoz → (Glikoz)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpiruvat → piruvat + ATP

Piruvat + NADH + H ⁺ → Laktat + NAD ⁺

Glikojen sentaz, UDP-glikozdan glikozu glikojene ekler. Bu işlemde üretilen UDP, ADP üreten bir reaksiyonda nükleozid difosfat kinaz (NDP kinaz) tarafından UTP’ye dönüştürülür. ADP, sırayla, daha sonra, bir fosfat donörü olarak fosfoenolpiruvat kullanarak ADP’yi fosforile eden piruvat kinaz için bir substrat görevi görür. Elde edilen piruvat, NADH tüketen bir reaksiyonda laktat dehidrogenaz enzimi tarafından laktata dönüştürülür. Bu nedenle tahlil, NADH tüketildikçe 340 nm’de absorbanstaki azalmayı izleyerek sürekli bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bir glikoz donörü olarak ADP-glikoz gerektiren enzimlerle kullanım için kolayca uyarlanmıştır. Burada, glikojen sentazın etkisiyle salınan ADP, doğrudan piruvat kinaz tarafından etki edildiğinden, bağlantı adımları daha basittir.

Glikojen fosforilaz aktivitesinin belirlenmesi için çeşitli spektrofotometrik testler mevcuttur. Klasik versiyonda, enzim aşağıda gösterildiği gibi glikojen sentezi yönünde geriye doğru sürülür:

(Glikoz) n + Glikoz-1-fosfat → (Glikoz)_n + _{1 +} P_i

Zamanlanmış aralıklarda, reaksiyon karışımının alikotları çıkarılır ve serbest bırakılan fosfat miktarı^12,13 olarak ölçülür. Ellerimizde, bu tahlil, fosforilaz etkisi için gerekli olan yüksek konsantrasyonlarda glikoz-1-fosfat ile birlikte, glikoz-1-fosfatın birçok ticari preparatında kolayca ölçülebilir serbest fosfatın varlığı nedeniyle sınırlı bir kullanım alanına sahiptir. Daha ziyade, glikojen fosforilaz¹³ tarafından parçalanırken salınan glikoz-1-fosfatı ölçen alternatif bir testi rutin olarak kullandık. Aşağıda gösterilen birleştirilmiş bir reaksiyon şeması kullanılır.

(Glikoz) n + P_i → (Glikoz)_n-1 + _{Glikoz-1-fosfat}

Glikoz-1-fosfat → Glikoz-6-fosfat

Glukoz-6-fosfat + NADP + → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H ⁺

Glikoz-1-fosfat, fosfoglukomutaz tarafından glikoz-6-fosfata dönüştürülür ve glikoz-6-fosfat daha sonra NADP ⁺ ‘nın NADPH’ye eşzamanlı indirgenmesi ile 6-fosfoglukonolakton’a oksitlenir. Aşağıdaki protokolün 2. bölümünde ayrıntılı olarak açıklanan prosedür, Mendicino ve ark.14 ve Schreiber & Bowling¹⁵ tarafından açıklanan yöntemlerden türetilmiştir. Tahlil, zaman içinde 340 nm’de absorbanstaki artışla sürekli bir şekilde kolayca gerçekleştirilebilir ve reaksiyon hızının belirlenmesine izin verir.

Dallanma enzimi aktivitesinin spektrofotometrik tayini, enzimin fosforilaz limitli dekstrin¹⁶ üzerindeki etkisiyle salınan glikozun ölçümüne dayanır. Bu bileşik, glikojen fosforilaz ile kapsamlı bir şekilde glikojen muamelesi yapılarak yapılır. Glikojen fosforilaz etkisi, 4 glikoz kalıntısını α1,6 dallı bir noktadan uzakta durdurduğundan, sınır dekstrin, dış zincirleri ~ 4 glikoz kalıntısına kısaltılmış glikojeni içerir. Fosforilaz limit dekstrinin hazırlanması, Taylor ve ^ark.17 ve Makino & Omichi¹⁸ tarafından geliştirilenlerden türetilen bir prosedür kullanılarak burada açıklanmaktadır.

Dallanma iki adımlı bir işlemdir. İki fonksiyonlu dallanma enziminin 4-α-glukanotransferaz aktivitesi ilk önce üç glikoz kalıntısını dal noktasından yakındaki α1,4 bağlı glikoz zincirinin indirgemesiz ucuna aktarır. Dallanma noktasında kalan tek, α1,6 bağlantılı glikoz kalıntısı daha sonra α1,6-glukozidaz aktivitesi¹⁹ tarafından hidrolize edilir. Tahlil tipik olarak durdurulmuş bir şekilde gerçekleştirilir, belirli bir süreden sonra salınan glikoz (veya bir dizi kez) aşağıda gösterildiği gibi birleştirilmiş bir enzim tahlilinde ölçülür:

(Glikoz) n → (Glikoz)_n-1 + Glikoz

Glikoz + ATP → Glikoz-6-fosfat + ADP

Glukoz-6-fosfat + NADP + → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H ⁺

Üretilen NADPH’nin belirlenmesi, glikoz üretiminin bir ölçüsünü verir. Aşağıdaki protokolün 3. bölümünde özetlenen prosedür, Nelson ve ^ark.16 tarafından açıklanan prosedüre dayanmaktadır. NADH / NADPH’nin tüketimine veya üretilmesine dayanan diğer yöntemler gibi, tahlil de oldukça hassastır. Bununla birlikte, fosforilaz limit dekstrinden serbest glikozu da serbest bırakabilen amilazların veya diğer glukozidazların varlığı, önemli bir girişime neden olacaktır (bkz.

Dallanan enzim aktivitesinin kolorimetrik tayini, α1,4 bağlı glikoz zincirlerinin, iyota bağlanan ve renkli kompleksler oluşturan sarmal yapıları benimsemesine dayanır²⁰. Oluşan kompleksin rengi, α1,4 bağlantılı zincirlerin uzunluğuna bağlıdır. Böylece, uzun, büyük ölçüde dallanmamış α1,4 bağlı glikoz zincirlerinden oluşan amiloz, iyot ile derin mavi bir kompleks oluşturur. Buna karşılık, dış zincirleri genellikle sadece 6 ila 8 glikoz kalıntısı uzunluğunda olan glikojen maddeler turuncu-kırmızı kompleksler oluşturur. Bir amiloz çözeltisi dallanma enzimi ile inkübe edilirse, dalların amiloza sokulması, daha kısa α1,4 bağlı glikoz zincirlerinin üretilmesiyle sonuçlanır. Böylece, amiloz / iyot komplekslerinin emilim maksimumu daha kısa dalga boylarına doğru kayar. Burada tartışılan prosedür, Boyer & Preiss²¹ tarafından detaylandırılan prosedürden türetilmiştir ve dallanma enzim aktivitesi, zamanla 660 nm’de amiloz / iyot kompleksinin emiliminde bir azalma olarak ölçülür.

Yukarıdaki tartışmadan kolayca anlaşılacağı gibi, iyot ve α1,4-glikoz zincirleri arasında oluşan komplekslerin renklerinin zincir uzunluğuna göre değişmesi, glikojen / iyot komplekslerinin absorbans spektrumlarının glikojen dallanma derecesine göre değişmesi gerektiği anlamına gelir. Bu gerçekten de böyledir ve daha uzun dış zincirlere sahip daha az dallanmış glikojen / glikojen maddeler, daha dallanmış / daha kısa dış zincirlere sahip glikojenlerden daha uzun bir dalga boyunda ışığı emer. Bu nedenle iyot boyama reaksiyonu, glikojen dallanma derecesi²² hakkında hızlı, kalitatif veriler elde etmek için kullanılabilir. Turuncu-kahverengi renk, iyotlu glikojen kompleksleri özellikle yoğun olmadığında oluşur. Bununla birlikte, doymuş kalsiyum klorür çözeltisi^22’nin dahil edilmesiyle renk gelişimi arttırılabilir. Bu, yöntemin duyarlılığını yaklaşık 10 kat artırır ve mikrogram glikojenin hazır analizine izin verir. Aşağıdaki protokolün 4. bölümünde açıklanan dallanmanın belirlenmesi için tahlil, Krisman²² tarafından geliştirilen bir prosedürden uyarlanmıştır. Glikojen numunesinin bir küvette iyot çözeltisi ve kalsiyum klorür ile birleştirilmesi ve absorpsiyon spektrumunun 330 nm ila 800 nm arasında toplanmasıyla gerçekleştirilir. Absorbans maksimumu, dallanma derecesi azaldıkça daha uzun dalga boylarına doğru kayar.

Toplu olarak, burada açıklanan yöntemler, glikojen metabolizmasının anahtar enzimlerinin aktivitelerini değerlendirmek ve glikojen dallanmasının derecesi hakkında nitel veriler elde etmek için basit, güvenilir araçlar sağlar.

Protocol

1. Glikojen sentaz aktivitesinin tayini Gerekli reaktiflerin stok çözeltilerini Tablo 1’de belirtildiği gibi hazırlayın (deney gününden önce). Parça Yol Tarifleri 50 mM Tris pH 8,0 0.61 g Tris bazını ~ 80 mL suda çözün.  4 °C’ye kadar soğutun.   HCl ile pH’ı 8,0’…

Representative Results

Glikojen sentaz aktivitesinin tayiniŞekil 1 , saflaştırılmış enzimler kullanılarak yapılan glikojen sentaz testlerinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Panel A’da, hafif bir gecikmenin ardından, yaklaşık 12 dakikalık bir süre boyunca zaman içinde 340 nm’de emilimde doğrusal bir azalma oldu. Şekil 1A’daki absorpsiyondaki değişim oranı ~ 0.12 absorbans birimi / dak idi. ~0.010 ila ~0.20 absorbans birimi / da…

Discussion

Genel olarak, sunulan tüm yöntemlerin temel avantajları, düşük maliyetleri, kolaylıkları, hızları ve özel ekipmanlara güvenmemeleridir. Hepsinin paylaştığı en büyük dezavantaj, mevcut diğer yöntemlere kıyasla hassasiyettir. NADH / NADPH üretimini veya tüketimini içeren prosedürlerin hassasiyetini tahmin etmek kolaydır. NADH / NADPH’nin yok olma katsayısının 6.22 M-1 ^cm-1 olduğu göz önüne alındığında, basit aritmetik konsantrasyondaki ~ ^10-20 μM değişikliklerin…

Materials

Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625