Spektrofotometriske metoder for studier av eukaryotisk glykogenmetabolisme

Summary

Teknikker for å måle aktiviteten til viktige enzymer av glykogenmetabolisme presenteres ved hjelp av et enkelt spektrofotometer som opererer i det synlige området.

Abstract

Glykogen syntetiseres som en lagringsform av glukose av et bredt spekter av organismer, alt fra bakterier til dyr. Molekylet består av lineære kjeder av α1,4-bundne glukoserester med grener introdusert ved tilsetning av α1,6-koblinger. Å forstå hvordan syntesen og nedbrytningen av glykogen reguleres og hvordan glykogen oppnår sin karakteristiske forgrenede struktur, krever studier av enzymer for glykogenlagring. Imidlertid bruker metodene som oftest brukes til å studere disse enzymaktivitetene, reagenser eller teknikker som ikke er tilgjengelige for alle etterforskere. Her diskuterer vi et batteri av prosedyrer som er teknisk enkle, kostnadseffektive og likevel i stand til å gi verdifull innsikt i kontrollen av glykogenlagring. Teknikkene krever tilgang til et spektrofotometer, som opererer i området 330 til 800 nm, og er beskrevet under forutsetning av at brukerne vil benytte engangs plastkuvetter. Prosedyrene er imidlertid lett skalerbare og kan modifiseres for bruk i en mikroplateleser, noe som muliggjør svært parallell analyse.

Introduction

Glykogen er utbredt i naturen, med forbindelsen som finnes i bakterier, mange protister, sopp og dyr. I mikroorganismer er glykogen viktig for celleoverlevelse når næringsstoffer er begrensende, og i høyere organismer som pattedyr tjener syntese og nedbrytning av glykogen til å buffere blodsukkernivået ^1,2,3. Studien av glykogenmetabolisme er derfor av betydning for så forskjellige felt som mikrobiologi og pattedyrfysiologi. Å forstå glykogenmetabolismen krever å studere de viktigste enzymene for glykogensyntese (glykogensyntase og forgreningsenzymet) og glykogennedbrytning (glykogenfosforylase og avgreningsenzym). Gullstandardanalysene av glykogensyntase, fosforylase, forgrening og debranching enzymaktiviteter benytter radioaktive isotoper. For eksempel måles glykogensyntase vanligvis i en stoppet radiokjemisk analyse ved å følge inkorporering av glukose fra UDP-[14 C] glukose (i tilfelle av dyre- og soppenzymer) eller ADP-[¹⁴C] glukose (i tilfelle av bakterielle enzymer) i glykogen ^4,5. Tilsvarende måles glykogenfosforylase i retning av glykogensyntese, etter inkorporering av glukose fra [¹⁴C]glukose-1-fosfat til glykogen⁶. Forgreningsenzymet analyseres ved å måle dette enzymets evne til å stimulere inkorporering av [14 C] glukose fra glukose-1-fosfat i α1,4-bundne kjeder av glykogenfosforylase⁷, og avgreningsenzymaktivitet bestemmes ved å følge enzymets evne til å inkorporere [¹⁴C] glukose i glykogen⁸ . Selv om de er svært følsomme, slik at de kan brukes i råcelleekstrakter med lave nivåer av enzymaktivitet, er de radioaktive substratene dyre og underlagt forskriftskravene som følger med radioisotopbruk. Disse barrierene plasserer bruken av visse analyser utenfor rekkevidde for mange arbeidstakere. I løpet av mange år har imidlertid et imponerende utvalg av spektrofotometriske tilnærminger til måling av disse enzymene blitt beskrevet. Generelt er disse tilnærmingene til slutt avhengige av å måle produksjonen eller forbruket av NADH / NADPH, eller genereringen av fargede komplekser mellom glykogen og jod. Dermed er de enkle og kan utføres ved hjelp av enkle spektrofotometere utstyrt med bare wolfram- eller xenonblitslamper.

Spektrofotometriske analyser av glykogensyntase er avhengige av å måle nukleosiddifosfatet frigjort fra sukkernukleotiddonoren når glukose tilsettes til den voksende glykogenkjeden ^9,10. Prosedyren for måling av glykogensyntaseaktivitet beskrevet i avsnitt 1 i protokollen nedenfor er en modifikasjon av den som er skissert av Wayllace et ^al.11, og koblingsskjemaet er vist nedenfor:

(Glukose) _n + UPD-glukose → (glukose)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpyruvat → pyruvat + ATP

Pyruvat + NADH + H + → Laktat + NAD ⁺

Glykogensyntase tilfører glukose fra UDP-glukose til glykogen. UDP generert i denne prosessen omdannes til UTP av nukleosiddifosfatkinase (NDP-kinase), i en reaksjon som genererer ADP. ADP tjener i sin tur som et substrat for pyruvatkinase, som fosforylerer ADP ved bruk av fosfoenolpyruvat som fosfatdonor. Det resulterende pyruvatet omdannes til laktat av enzymet laktatdehydrogenase i en reaksjon som forbruker NADH. Analysen kan derfor utføres kontinuerlig, og overvåker reduksjonen i absorbans ved 340 nm når NADH forbrukes. Det er lett tilpasset for bruk med enzymer som krever ADP-glukose som glukosedonor. Her er koblingstrinnene enklere siden ADP frigjort ved virkningen av glykogensyntase påvirkes direkte av pyruvatkinase.

Det finnes en rekke spektrofotometriske analyser tilgjengelig for bestemmelse av glykogenfosforylaseaktivitet. I den klassiske versjonen drives enzymet bakover, i retning av glykogensyntese, som vist nedenfor:

(Glukose) _n + glukose-1-fosfat → (glukose)_n+1 + P_i

Ved tidsbestemte intervaller fjernes aliquots av reaksjonsblandingen, og mengden fosfatfrigjort kvantifiseres^12,13. I våre hender har denne analysen vært av begrenset bruk på grunn av tilstedeværelsen av lett målbart fritt fosfat i mange kommersielle preparater av glukose-1-fosfat, kombinert med de høye konsentrasjonene av glukose-1-fosfat som kreves for fosforylasevirkning. Snarere har vi rutinemessig brukt en alternativ analyse som måler glukose-1-fosfat frigjort som glykogen nedbrytes av fosforylase¹³. En koblet reaksjonsordning, illustrert nedenfor, er brukt.

(Glukose) n + P_i → (glukose)_n-1 + _{glukose-1-fosfat}

Glukose-1-fosfat → glukose-6-fosfat

Glukose-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H⁺

Glukose-1-fosfatet omdannes til glukose-6-fosfat av fosfoglukomutase, og glukose-6-fosfatet oksyderes deretter til 6-fosfoglukonolakton, med samtidig reduksjon av NADP ⁺ til NADPH. Prosedyren beskrevet i avsnitt 2 i protokollen nedenfor er avledet fra metoder beskrevet av Mendicino et al.14 og Schreiber & Bowling ¹⁵. Analysen kan lett utføres kontinuerlig, med økning i absorbans ved 340 nm over tid, slik at reaksjonshastigheten kan bestemmes.

Spektrofotometrisk bestemmelse av avgrenende enzymaktivitet er avhengig av måling av glukosen frigjort ved enzymets virkning på fosforylasegrense^{dekstrin 16}. Denne forbindelsen er laget ved å behandle glykogen uttømmende med glykogenfosforylase. Siden glykogenfosforylasevirkningen stopper 4 glukoserester fra et α1,6-grenpunkt, inneholder grensen dekstrin glykogen, hvis ytre kjeder er forkortet til ~ 4 glukoserester. Fremstilling av fosforylasegrense dextrin er beskrevet her, ved hjelp av en prosedyre avledet fra de som er utviklet av Taylor et al.17 og Makino &Omichi ¹⁸.

Debranching er en to-trinns prosess. 4-α-glukanotransferaseaktiviteten til det bifunksjonelle avgreningsenzymet overfører først tre glukoserester fra grenpunktet til den ikke-reduserende enden av en nærliggende α1,4-bundet glukosekjede. Den enkle, α1,6-bundne glukoseresten som er igjen ved grenpunktet, hydrolyseres deretter av α1,6-glukosidaseaktiviteten¹⁹. Analysen utføres vanligvis på en stoppet måte, glukosen frigjøres etter en gitt tid (eller serie ganger) måles i en koblet enzymanalyse som vist nedenfor:

(Glukose) n → (glukose)_n-1 + glukose

Glukose + ATP → glukose-6-fosfat + ADP

Glukose-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H⁺

Bestemmelsen av NADPH produsert gir et mål på glukoseproduksjon. Prosedyren som er skissert i avsnitt 3 i protokollen nedenfor, er basert på en som er beskrevet av Nelson et ^al.16. Som de andre metodene som er avhengige av forbruk eller generering av NADH / NADPH, er analysen ganske følsom. Imidlertid vil tilstedeværelsen av amylaser eller andre glukosidaser, som også kan frigjøre fri glukose fra fosforylasegrense dextrin, forårsake betydelig forstyrrelse (se diskusjon).

Den kolorimetriske bestemmelsen av forgreningsenzymaktivitet er avhengig av det faktum at α1,4-bundne kjeder av glukose vedtar spiralformede strukturer som binder seg til jod, og danner fargede komplekser²⁰. Fargen på komplekset som dannes avhenger av lengden på α1,4-bundne kjeder. Dermed danner amylose, som består av lange, stort sett uforgrenede kjeder av α1,4-bundet glukose, et dypblått kompleks med jod. I motsetning til dette danner glykogener, hvis ytre kjeder vanligvis er i størrelsesorden bare 6 til 8 glukoserester lange, oransje-røde komplekser. Hvis en løsning av amylose inkuberes med forgreningsenzym, resulterer innføringen av grener i amylosen i generering av kortere α1,4-bundne glukosekjeder. Dermed skifter absorpsjonsmaksimumet til amylose/jodkompleksene mot kortere bølgelengder. Prosedyren diskutert her er avledet fra det som er beskrevet av Boyer & Preiss²¹ og forgreningsenzymaktivitet kvantifiseres som en reduksjon i absorpsjon av amylose / jodkomplekset ved 660 nm over tid.

Som det fremgår av diskusjonen ovenfor, betyr det faktum at fargene på kompleksene dannet mellom jod og α1,4-glukosekjeder varierer med kjedelengden, at absorbansspektrene til glykogen / jodkomplekser bør variere med graden av glykogenforgrening. Dette er faktisk tilfelle, og mindre forgrenede glykogener / glykogener med lengre ytre kjeder absorberer lys ved en lengre bølgelengde enn glykogener som er mer forgrenede / har kortere ytre kjeder. Jodfargingsreaksjonen kan derfor brukes til å få raske, kvalitative data om graden av glykogenforgrening²². Den oransjebrune fargen dannes når glykogenkomplekser med jod ikke er spesielt intense. Imidlertid kan fargeutviklingen forbedres ved inkludering av mettet kalsiumkloridoppløsning²². Dette øker følsomheten til metoden rundt 10 ganger og tillater klar analyse av mikrogrammengder glykogen. Analysen for bestemmelse av forgrening beskrevet i avsnitt 4 i protokollen, nedenfor, er tilpasset fra en prosedyre utviklet av Krisman²². Det utføres ganske enkelt ved å kombinere glykogenprøven med jodoppløsning og kalsiumklorid i en kyvette og samle absorpsjonsspekteret fra 330 nm til 800 nm. Absorbansmaksimumet forskyves mot lengre bølgelengder etter hvert som graden av forgrening avtar.

Samlet gir metodene beskrevet her enkle, pålitelige midler for å vurdere aktivitetene til nøkkelenzymene for glykogenmetabolisme, og for å oppnå kvalitative data om omfanget av glykogenrenering.

Protocol

1. Bestemmelse av glykogensyntaseaktivitet Klargjør stamløsninger av nødvendige reagenser som angitt i tabell 1 (før forsøksdagen). Komponent Veibeskrivelser 50 mM Tris pH 8,0 Løs opp 0,61 g Tris-basen i ~ 80 ml vann.  Chill til 4 ° C.   Juster pH til 8,0 med HCl og gjør …

Representative Results

Bestemmelse av glykogensyntaseaktivitetFigur 1 viser representative resultater fra glykogensyntaseanalyser med rensede enzymer. I panel A, etter et lite etterslep, var det en lineær reduksjon i absorpsjonen ved 340 nm over tid i en periode på rundt 12 minutter. Endringshastigheten i absorpsjon i figur 1A var ~0,12 absorbansenheter/min. En endringshastighet i absorbans mellom ~0,010 og ~0,20 absorbansenheter/min er optimal, og mengden tilsa…

Discussion

Generelt er de viktigste fordelene ved alle metodene som presenteres deres lave kostnader, letthet, hastighet og mangel på avhengighet av spesialutstyr. Den største ulempen som de alle deler er følsomhet sammenlignet med andre tilgjengelige metoder. Sensitiviteten til prosedyrene som involverer produksjon eller forbruk av NADH / NADPH er enkle å estimere. Gitt at utryddelseskoeffisienten til NADH / NADPH er 6,22 M-1 ^cm-1 , indikerer enkel aritmetikk at ~ ^10-20 μM endringer i konsentrasjon lett …

Materials

Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625