Her presenteres en protokoll for effektiv og nøyaktig screening av tobakkgenotyper for Phytophthora nicotianae motstand i frøplanter. Dette er en praktisk tilnærming for presisjonsavl, samt molekylær mekanismeforskning.
Svart skaft, forårsaket av oomycetes Phytophthora nicotianae, er ødeleggende for tobakk, og dette patogenet er svært patogent for mange solanaceous avlinger. P. nicotianae er godt tilpasset høye temperaturer; Derfor får forskning på dette patogenet betydning i landbruket over hele verden på grunn av global oppvarming. P. nicotianae-resistente varianter av tobakksplanter blir ofte screenet av inokulasjon med havrekorn kolonisert av P. nikotianae og overvåking for sykdomssymptomene. Det er imidlertid vanskelig å kvantifisere inokulasjonsintensiteten siden nøyaktig inokulasjon er avgjørende i dette tilfellet. Denne studien hadde som mål å utvikle en effektiv og pålitelig metode for å evaluere motstanden av tobakk mot infeksjon med P. nicotianae. Denne metoden har blitt brukt til å identifisere resistente varianter, og inokulasjonseffektiviteten ble bekreftet av sanntids PCR. Motstandsevalueringsmetoden som presenteres i denne studien er effektiv og praktisk for presisjonsavl, samt molekylær mekanismeforskning.
P. nicotianae er ødeleggende for mange solanaceous avlinger. Det kan forårsake tobakk “svart skaft”1, potetfoviar og knollrot2, tomat og søt pepperkrone og rotrot3, og Goji krage og rotrot4. P. nicotianae kan angripe alle deler av tobakksplanter, inkludert røttene, stilkene og bladene i ethvert voksende stadium5. Det vanligste symptomet på sykdommen er den svarte basen av stilken. Røttene er i utgangspunktet synlige som vann-gjennomvåt og blir deretter nekrotiske, og bladene viser store sirkulære lesjoner5. Denne sykdommen kan være ødeleggende for en tobakksplante i drivhuset, så vel som i feltet6. Den mest praktiske og økonomiske metoden for å kontrollere P. nicotianae er bruken av resistente varianter7. Imidlertid er det nødvendig med en effektiv screeningprotokoll for identifisering av P. nicotianae-resistente tiltredelser fra tobakkskimplasmasamlinger.
Ulike identifikasjonsmetoder er beskrevet for å vurdere P. nicotianae motstand i tobakk7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Generelt har tre store tilnærminger blitt brukt til identifisering av P. nicotianae-resistente tobakksgenotyper. Den første inkluderer blanding av mycelia med agarmedium på Petri-plater som inneholder P. nicotianae. Mycelia blir deretter dyrket i mørket ved romtemperatur i 2 uker. 1 L deionisert vann tilsettes til mycelia og homogeniseres i 30 s. Inokulumet holdes på is til det er nødvendig. To hull (1 cm i diameter og 4-5 cm dyp) er laget på hver side av planten, og 10 ml av inokulumet helles i hvert hull. Hullene fylles deretter med den omkringliggende jorda, og sykdomsutvikling overvåkes daglig i 2 uker8,10.
I den andre metoden er plantene inokulert med patogeninfisert tannpirkere. For denne tilnærmingen bør plantene brukes ca 6 uker etter transplantasjon og bør ha en minimumshøyde på 30 cm. Autoklavede tannpirkere er plassert på overflaten av kulturer som inneholder P. nicotianae mycelia. Kulturrettene lagres deretter under lyset ved romtemperatur i 7 dager. Deretter brukes koloniserte tannpirkere til å inokulere plantene. Tannpirkere settes inn i tobakksstenglene mellom fjerde og femte node. Plantene overvåkes daglig i 5 dager9,15. Denne metoden gjelder ikke for små frøplanter. Siden inokulumet er patogeninfisert tannpirkere, kan inokulasjonsintensiteten ikke kontrolleres nøyaktig.
Den mest brukte tilnærmingen innebærer havrekorn for inokulasjon. I dette tilfellet fremstilles havrekorn ved autoklavering av 500 ml havre og 300 ml deionisert vann ved 121 °C i 1 time én gang per dag i 3 dager. Deretter legges havrekorn til det patogenkoloniserte kulturmediet. Rettene er forseglet med parafinfilm og inkubert ved 25 °C i lys i 7-12 dager. Fire separate 5 cm dype hull er laget på pottejorden, 4 cm fra hver plante, og ett patogeninfisert havrekorn plasseres i hvert hull. Inkubasjonsperioden bestemmes ut fra når det første symptomet ovenfor forekommer7,11,12,13,14,15,16. Denne metoden er effektiv og anvendelig for screening av storskala motstand. En begrensning ved denne tilnærmingen er imidlertid at inokulumet er patogeninfisert havrekorn, derfor kan inokulasjonsintensiteten ikke kontrolleres nøyaktig.
Men presentert her er en mer nøyaktig metode som gjelder for vekstkammermotstandsevaluering. Sammenlignet med de andre tilnærmingene er inokulumet zoospor suspensjon, derfor er inokulasjonsintensiteten kontrollerbar og justerbar. Ettersom tobakksplantene i denne studien dyrkes uten jord, er resultatene lettere å observere. Videre forårsaker prøvetaking av planterøtter fra jord alltid skade på røttene, noe som induserer en rekke fysiologiske responser17. I denne metoden, som planter dyrkes uten jord, kan forstyrrelsen i rotskade elimineres. Til slutt er denne metoden mer praktisk for molekylær mekanismeforskning og presisjonsavl. Ved hjelp av denne protokollen oppnås data vanligvis innen 5 dager, med mer enn 200 planter evaluert i et enkelt eksperiment.
Flere motstandskilder har blitt brukt til å forbedre P. nicotianae motstand i dyrket tobakk. Enkelt dominerende R-gener, Php og Phl, har blitt introgressert fra henholdsvis Nicotiana plumbaginifolia og Nicotiana longiflora. Sigartobakken Beinhart 1000 har det høyeste rapporterte nivået av kvantitativ motstand mot P. nicotianae13. Flere intervallkartleggingsforsøk har antydet at minst seks kvantitative trekkloci (QTLe…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (31571738) og Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).
(NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
(NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |