כאן, פרוטוקול מוצג עבור הקרנה יעילה ומדויקת של גנוטיפים טבק עבור Phytophthora nicotianae התנגדות שתילים. זוהי גישה מעשית לרבייה מדויקת, כמו גם מחקר מנגנון מולקולרי.
שוק שחור, הנגרם על ידי oomycetes Phytophthora nicotianae, הוא הרסני לטבק, ופתוגן זה הוא מאוד פתוגניים לגידולים סולאנים רבים. P. nicotianae מותאם היטב לטמפרטורות גבוהות; לכן, מחקר על פתוגן זה צובר חשיבות בחקלאות ברחבי העולם בגלל ההתחממות הגלובלית. P. זנים עמידים nicotianae של צמחי טבק נבדקים בדרך כלל על ידי חיסון עם גרגרי שיבולת שועל מיושב על ידי P. nicotianae וניטור עבור תסמיני המחלה. עם זאת, קשה לכמת את עוצמת החיסון שכן חיסון מדויק הוא קריטי במקרה זה. מחקר זה נועד לפתח שיטה יעילה ואמינה להערכת ההתנגדות של טבק לזיהום עם P. nicotianae. שיטה זו שימשה בהצלחה לזיהוי זנים עמידים, ויעילות החיסון אושרה על ידי PCR בזמן אמת. שיטת הערכת ההתנגדות המוצגת במחקר זה יעילה ומעשית לרבייה מדויקת, כמו גם לחקר מנגנון מולקולרי.
P. nicotianae הוא הרסני לגידולים סולאנים רבים. זה יכול לגרום טבק “שוק שחור”1, פוליאר תפוחי אדמה ו פקעת rot2, כתר עגבניות ופלפל מתוק ורוט שורש3, וצווארון גוג’י ורוט שורש4. P. nicotianae יכול לתקוף את כל חלקי צמחי הטבק, כולל השורשים, הגבעולים והעלים בכל שלב גידול5. הסימפטום הנפוץ ביותר של המחלה הוא הבסיס השחור של הגבעול. השורשים נראים בתחילה כמו ספוג מים ולאחר מכן להיות נמק, והעלים מראים נגעים מעגליים גדולים5. מחלה זו יכולה להיות הרסנית לצמח טבק בחממה, כמו גם בתחום6. השיטה המעשית והחסכונית ביותר לשליטה P. nicotianae היא השימוש זנים עמידים7. עם זאת, פרוטוקול סינון יעיל נדרש לזיהוי של P. nicotianae עמיד גישות מאוספי נבט טבק.
שיטות זיהוי שונות תוארו כדי להעריך עמידות P. nicotianae בטבק7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. באופן כללי, שלוש גישות עיקריות שימשו לזיהוי של גנוטיפי טבק עמידים P. nicotianae. הראשון כולל ערבוב תפטירים עם מדיום אגר על צלחות פטרי המכילות P. nicotianae. התפטיר מעובד לאחר מכן בחושך בטמפרטורת החדר במשך שבועיים. 1 L של מים deionized מתווסף תפטיר הומוגני במשך 30 s. החיסון נשמר על קרח עד הצורך. שני חורים (בקוטר 1 ס”מ ועומק 4-5 ס”מ) מיוצרים בכל צד של הצמח, ו -10 מ”ל של אינוקולום נשפך לתוך כל חור. לאחר מכן החורים מלאים בקרקע שמסביב, והתפתחות המחלה מנוטרת מדי יום במשך שבועיים8,10.
בשיטה השנייה, הצמחים מחוסנים עם קיסמי שיניים שורצי פתוגן. עבור גישה זו, הצמחים יש להשתמש כ 6 שבועות לאחר ההשתלה צריך להיות בגובה מינימלי של 30 ס”מ. קיסמי שיניים משועבדים אוטומטית ממוקמים על פני השטח של תרבויות המכילות תפטיאני P. nicotianae תפטיאניה. מנות התרבות מאוחסנות לאחר מכן תחת האור בטמפרטורת החדר במשך 7 ימים. לאחר מכן, קיסמי שיניים קולוניאליים משמשים לחסן את הצמחים. קיסמי שיניים מוכנסים לתוך גבעולי הטבק בין הצמתים הרביעי והחמישי. הצמחים מנוטרים מדי יום במשך 5 ימים9,15. שיטה זו אינה ישימה עבור שתילים קטנים. מכיוון שהאינוקולום הוא קיסמי שיניים שורצי פתוגן, לא ניתן לשלוט במדויק בעוצמת החיסון.
הגישה הנפוצה ביותר כוללת גרגרי שיבולת שועל לחיסון. במקרה זה, גרגרי שיבולת שועל מוכנים על ידי autoclaving 500 מ”ל של שיבולת שועל ו 300 מ”ל של מים deionized ב 121 °C (65 °F) עבור 1 שעה פעם ביום במשך 3 ימים. לאחר מכן, גרגרי שיבולת שועל מתווספים למדיום התרבות קולוניאלית פתוגן. הכלים חתומים בסרט פרפין ודגרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס לאור במשך 7-12 ימים. ארבעה חורים נפרדים בעומק 5 ס”מ מיוצרים על אדמת העציצים, 4 ס”מ מכל צמח, ודגר שיבולת שועל שורץ פתוגן אחד ממוקם בכל חור. תקופת הדגירה נקבעת על סמך מתי מתרחשת הסימפטום הראשון מעל פני הקרקע7,11,12,13,14,15,16. שיטה זו יעילה וישימה להקרנת התנגדות בקנה מידה גדול. עם זאת, מגבלה אחת של גישה זו היא כי inoculum הוא גרגרי שיבולת שועל שורץ פתוגן, ולכן עוצמת החיסון לא ניתן לשלוט במדויק.
עם זאת, מוצג כאן היא שיטה מדויקת יותר כי הוא ישים להערכת התנגדות תא הצמיחה. בהשוואה לגישות האחרות, החיסון הוא השעיית zoospore, ומכאן עוצמת החיסון ניתנת לשליטה ומכוונת. כמו צמחי הטבק במחקר זה מעובדים ללא אדמה, התוצאות קלות יותר לצפייה. יתר על כן, דגימת שורשי צמחים מהאדמה תמיד גורמת נזק לשורשים, מה שגורם לסדרה של תגובות פיזיולוגיות17. בשיטה זו, כמו צמחים מעובדים ללא אדמה, ההפרעה בנזק השורש ניתן לבטל. לסיכום, שיטה זו היא מעשית יותר למחקר מנגנון מולקולרי ורבייה מדויקת. באמצעות פרוטוקול זה, נתונים מתקבלים בדרך כלל בתוך 5 ימים, עם יותר מ 200 צמחים מוערכים בניסוי אחד.
מקורות התנגדות מרובים שימשו כדי לשפר את P. nicotianae עמידות בטבק מעובד. גנים דומיננטיים יחידים R, Php ו– Phl, כבר מופנם מ Nicotiana plumbaginifolia ו Nicotiana longiflora, בהתאמה 10. מגוון טבק הסיגרים Beinhart 1000 יש את הרמה המדווחת הגבוהה ביותר של עמידות כמותית P. nicotianae13. נ…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31571738) והתוכנית לחדשנות במדע וטכנולוגיה חקלאית של סין (ASTIP-TRIC01).
(NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
(NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |