Screening af tobaksgenotyper for phytophthora nicotianaeresistens
Summary
Her præsenteres en protokol til effektiv og nøjagtig screening af tobaksgenotyper for Phytophthora nicotianae-resistens hos frøplanter. Dette er en praktisk tilgang til præcisionsavl samt molekylær mekanismeforskning.
Abstract
Sort skaft, forårsaget af oomycetes Phytophthora nicotianae, er ødelæggende for tobak, og dette patogen er højpatogent for mange solanaceous afgrøder. P. nicotianae er velegnet til høje temperaturer; derfor får forskning i dette patogen betydning i landbruget over hele verden på grund af den globale opvarmning. P. nicotianae-resistente sorter af tobaksplanter screenes almindeligvis ved podning med havrekorn koloniseret af P. nicotianae og overvågning af sygdomssymptomerne. Det er imidlertid vanskeligt at kvantificere podningsintensiteten, da nøjagtig podning er afgørende i dette tilfælde. Denne undersøgelse havde til formål at udvikle en effektiv og pålidelig metode til evaluering af tobaks resistens over for infektion med P. nicotianae. Denne metode er med succes blevet brugt til at identificere resistente sorter, og podningseffektiviteten blev bekræftet af PCR i realtid. Resistensevalueringsmetoden, der præsenteres i denne undersøgelse, er effektiv og praktisk til præcisionsforædling samt molekylær mekanismeforskning.
Introduction
P. nicotianae er ødelæggende for mange solanaceous afgrøder. Det kan forårsage tobak “sort skaft”1, kartoffelblad og knoldrot2, tomat og sød peber krone og rodrot3 og Goji krave og rodrot4. P. nicotianae kan angribe alle dele af tobaksplanter, herunder rødder, stilke og blade på ethvert vækststadium5. Det mest almindelige symptom på sygdommen er den sorte base af stilken. Rødderne er oprindeligt synlige som vandgennemblødte og bliver derefter nekrotiske, og bladene viser store cirkulære læsioner5. Denne sygdom kan være ødelæggende for en tobaksplante i drivhuset såvel som i marken6. Den mest praktiske og økonomiske metode til bekæmpelse af P. nicotianae er brugen af resistente sorter7. Der kræves imidlertid en effektiv screeningsprotokol til identifikation af P. nicotianae-resistente tiltrædelser fra tobakskimplasmasamlinger.
Forskellige identifikationsmetoder er blevet beskrevet for at vurdere P. nicotianae-resistens i tobak7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Generelt er der anvendt tre hovedtilgange til identifikation af P. nicotianae-resistente tobaksgenotyper. Den første omfatter blanding af mycelier med agarmedium på Petri-plader indeholdende P. nicotianae. Mycelien dyrkes derefter i mørke ved stuetemperatur i 2 uger. 1 liter deioniseret vand tilsættes mycelien og homogeniseres i 30 s. Inokulumet holdes på is, indtil det er nødvendigt. To huller (1 cm i diameter og 4-5 cm dybe) er lavet på hver side af planten, og 10 ml af inokulumet hældes i hvert hul. Hullerne fyldes derefter med den omgivende jord, og sygdomsudviklingen overvåges dagligt i 2 uger8,10.
I den anden metode podes planterne med patogeninficerede tandstikkere. Til denne tilgang skal planterne anvendes ca. 6 uger efter transplantation og skal have en minimumshøjde på 30 cm. Autoklaverede tandstikkere placeres på overfladen af kulturer, der indeholder P. nicotianae mycelia. Kulturretterne opbevares derefter under lyset ved stuetemperatur i 7 dage. Derefter bruges koloniserede tandstikkere til at inokulere planterne. Tandstikkere indsættes i tobaksstængerne mellem fjerde og femte knude. Planterne overvåges dagligt i 5 dage9,15. Denne metode er ikke anvendelig til små frøplanter. Da inokulumet er patogeninficerede tandstikkere, kan podningsintensiteten ikke kontrolleres præcist.
Den mest anvendte tilgang involverer havrekorn til podning. I dette tilfælde fremstilles havrekorn ved autoklavering af 500 ml havre og 300 ml deioniseret vand ved 121 ° C i 1 time en gang om dagen i 3 dage. Derefter tilsættes havrekorn til det patogenkoloniserede kulturmedium. Skålene forsegles med paraffinfilm og inkuberes ved 25 ° C i lys i 7-12 dage. Fire separate 5 cm dybe huller er lavetpå pottejorden, 4 cm fra hver plante, og et patogeninficeret havrekorn placeres i hvert hul. Inkubationstiden bestemmes ud fra, hvornår det første overjordiske symptom opstår7,11,12,13,14,15,16. Denne metode er effektiv og anvendelig til modstandsscreening i stor skala. En begrænsning ved denne tilgang er imidlertid, at inokulumet er patogeninficerede havrekorn, hvorfor podningsintensiteten ikke kan kontrolleres præcist.
Men præsenteret her er en mere præcis metode, der gælder for vækstkammerresistensevaluering. Sammenlignet med de andre tilgange er inokulumet zoosporesuspension, hvorfor podningsintensiteten er kontrollerbar og justerbar. Da tobaksplanterne i denne undersøgelse dyrkes uden jord, er resultaterne lettere at observere. Desuden forårsager prøveudtagning af planterødder fra jord altid skade på rødderne, hvilket inducerer en række fysiologiske reaktioner17. I denne metode, da planter dyrkes uden jord, kan interferensen i rodskader elimineres. Afslutningsvis er denne metode mere praktisk til molekylær mekanismeforskning og præcisionsavl. Ved hjælp af denne protokol opnås data typisk inden for 5 dage, hvor mere end 200 planter evalueres i et enkelt eksperiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere resistenskilder er blevet brugt til at forbedre P. nicotianae-resistens i dyrket tobak. Enkelt dominerende R-gener, Php og Phl, er blevet introgresseret fra henholdsvis Nicotiana plumbaginifolia og Nicotiana longiflora10. Cigartobakssorten Beinhart 1000 har det højeste rapporterede niveau af kvantitativ resistens over for P. nicotianae13. Flere intervalkortlægningseksperimenter har antydet, at mindst seks kvantit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (31571738) og Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
Riferimenti
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco ‘Beinhart 1000’ × ‘Hicks’ mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. . GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
