Dépistage de la résistance à Phytophthora nicotianae des génotypes du tabac
Summary
Ici, un protocole est présenté pour le dépistage efficace et précis des génotypes de tabac pour la résistance à Phytophthora nicotianae chez les semis. Il s’agit d’une approche pratique pour la sélection de précision, ainsi que pour la recherche sur les mécanismes moléculaires.
Abstract
Le jarret noir, causé par les oomycètes Phytophthora nicotianae, est destructeur pour le tabac, et cet agent pathogène est hautement pathogène pour de nombreuses cultures solanacées. P. nicotianae est bien adapté aux températures élevées; par conséquent, la recherche sur cet agent pathogène gagne en importance dans l’agriculture du monde entier en raison du réchauffement climatique. Les variétés de plants de tabac résistantes à P. nicotianae sont généralement dépistées par inoculation avec des grains d’avoine colonisés par P. nicotianae et par surveillance des symptômes de la maladie. Cependant, il est difficile de quantifier l’intensité de l’inoculation car une inoculation précise est cruciale dans ce cas. Cette étude visait à développer une méthode efficace et fiable pour évaluer la résistance du tabac à l’infection par P. nicotianae. Cette méthode a été utilisée avec succès pour identifier les variétés résistantes, et l’efficacité de l’inoculation a été confirmée par PCR en temps réel. La méthode d’évaluation de la résistance présentée dans cette étude est efficace et pratique pour la sélection de précision, ainsi que pour la recherche sur les mécanismes moléculaires.
Introduction
P. nicotianae est destructeur pour de nombreuses cultures solanacées. Il peut causer la « jarret noir »1 du tabac, la pourriture foliaire et tuberculeuse de la pomme de terre2, la pourriture de la couronne et de la racine de la tomate et du poivron doux3, ainsi que la pourriture du collier et des racines de Goji4. P. nicotianae peut attaquer toutes les parties des plants de tabac, y compris les racines, les tiges et les feuilles à n’importe quel stade de croissance5. Le symptôme le plus courant de la maladie est la base noire de la tige. Les racines sont d’abord visibles comme imbibées d’eau, puis deviennent nécrotiques, et les feuilles présentent de grandes lésions circulaires5. Cette maladie peut être dévastatrice pour une plante de tabac dans la serre, ainsi que sur le terrain6. La méthode la plus pratique et la plus économique pour lutter contre P. nicotianae est l’utilisation de variétés résistantes7. Cependant, un protocole de dépistage efficace est nécessaire pour l’identification des accessions résistantes à P. nicotianae provenant des collections de matériel génétique du tabac.
Diverses méthodes d’identification ont été décrites pour évaluer la résistance à P. nicotianae dans le tabac7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. En général, trois approches principales ont été utilisées pour l’identification des génotypes de tabac résistants à P. nicotianae. La première consiste à mélanger le mycélium avec un milieu agar sur des plaques de Petri contenant P. nicotianae. Les mycéliums sont ensuite cultivés dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 semaines. 1 L d’eau désionisée est ajoutée au mycélium et homogénéisée pendant 30 s. L’inoculum est conservé sur la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. Deux trous (1 cm de diamètre et 4-5 cm de profondeur) sont faits de chaque côté de la plante, et 10 mL de l’inoculum sont versés dans chaque trou. Les trous sont ensuite remplis avec le sol environnant et le développement de la maladie est surveillé quotidiennement pendant 2 semaines8,10.
Dans la deuxième méthode, les plantes sont inoculées avec des cure-dents infestés d’agents pathogènes. Pour cette approche, les plantes doivent être utilisées environ 6 semaines après le repiquage et doivent avoir une hauteur minimale de 30 cm. Les cure-dents autoclavés sont placés à la surface des cultures contenant P. nicotianae mycelia. Les plats de culture sont ensuite conservés à la lumière à température ambiante pendant 7 jours. Ensuite, des cure-dents colonisés sont utilisés pour inoculer les plantes. Les cure-dents sont insérés dans les tiges de tabac entre les quatrième et cinquième nœuds. Les plantes sont surveillées quotidiennement pendant 5 jours9,15. Cette méthode ne s’applique pas aux petits semis. Comme l’inoculum est infesté de cure-dents infestés d’agents pathogènes, l’intensité de l’inoculation ne peut pas être contrôlée avec précision.
L’approche la plus fréquemment utilisée implique des grains d’avoine pour l’inoculation. Dans ce cas, les grains d’avoine sont préparés par autoclavage 500 mL d’avoine et 300 mL d’eau désionisée à 121 °C pendant 1 h une fois par jour pendant 3 jours. Ensuite, des grains d’avoine sont ajoutés au milieu de culture colonisé par un agent pathogène. Les plats sont scellés avec un film de paraffine et incubés à 25 ° C à la lumière pendant 7 à 12 jours. Quatre trous séparés de 5 cm de profondeur sont faits sur le terreau, à 4 cm de chaque plante, et un grain d’avoine infesté d’agents pathogènes est placé dans chaque trou. La période d’incubation est déterminée en fonction du moment où le premier symptôme en surface se produit7,11,12,13,14,15,16. Cette méthode est efficace et applicable pour le criblage de résistance à grande échelle. Cependant, l’une des limites de cette approche est que l’inoculum est constitué de grains d’avoine infestés d’agents pathogènes, de sorte que l’intensité de l’inoculation ne peut pas être contrôlée avec précision.
Cependant, présenté ici est une méthode plus précise qui est applicable à l’évaluation de la résistance de la chambre de croissance. Par rapport aux autres approches, l’inoculum est en suspension de zoospore, d’où l’intensité de l’inoculation est contrôlable et réglable. Comme les plants de tabac de cette étude sont cultivés sans sol, les résultats sont plus faciles à observer. De plus, l’échantillonnage des racines des plantes dans le sol endommage toujours les racines, ce qui induit une série de réponses physiologiques17. Dans cette méthode, comme les plantes sont cultivées sans sol, l’interférence dans les dommages aux racines peut être éliminée. En conclusion, cette méthode est plus pratique pour la recherche sur les mécanismes moléculaires et la sélection de précision. En utilisant ce protocole, les données sont généralement obtenues dans les 5 jours, avec plus de 200 plantes évaluées en une seule expérience.
Protocol
Representative Results
Discussion
De multiples sources de résistance ont été utilisées pour améliorer la résistance à P. nicotianae dans le tabac cultivé. Les gènes R dominants uniques, Php et Phl, ont été introduits à partir de Nicotiana plumbaginifolia et Nicotiana longiflora, respectivement10. La variété de tabac à cigares Beinhart 1000 a le plus haut niveau de résistance quantitative signalé à P. nicotianae13. De multiples expérien…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31571738) et le Programme d’innovation en sciences et technologies agricoles de Chine (ASTIP-TRIC01).
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
Riferimenti
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