Mejorar la reproducibilidad para cumplir con la información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 Directrices en el análisis de seguimiento de nanopartículas

Summary

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es un método ampliamente utilizado para caracterizar vesículas extracelulares. Este artículo destaca los parámetros y controles experimentales de NTA, además de un método uniforme de análisis y caracterización de muestras y diluyentes necesarios para complementar las pautas propuestas por MISEV2018 y EV-TRACK para la reproducibilidad entre laboratorios.

Abstract

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) ha sido uno de los varios métodos de caracterización utilizados para la investigación de vesículas extracelulares (EV) desde 2006. Muchos consideran que los instrumentos NTA y sus paquetes de software se pueden utilizar fácilmente después de una capacitación mínima y que la calibración del tamaño es factible internamente. Como tanto la adquisición de NTA como el análisis de software constituyen la caracterización de EV, se abordan en Información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 (MISEV2018). Además, han sido monitoreados por Transparent Reporting y Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) para mejorar la robustez de los experimentos ev (por ejemplo, minimizar la variación experimental debido a factores no controlados).

A pesar de los esfuerzos para fomentar el informe de métodos y controles, muchos trabajos de investigación publicados no informan los entornos críticos necesarios para reproducir las observaciones originales de NTA. Pocos artículos informan de la caracterización NTA de controles o diluyentes negativos, asumiendo evidentemente que los productos disponibles comercialmente, como la solución salina tamponada con fosfato o el agua destilada ultrapura, están libres de partículas. Del mismo modo, los controles positivos o los estándares de tamaño rara vez son reportados por los investigadores para verificar el tamaño de las partículas. La ecuación de Stokes-Einstein incorpora variables de viscosidad y temperatura de la muestra para determinar el desplazamiento de partículas. Informar de la temperatura estable de la cámara láser durante toda la recolección de video de muestra es, por lo tanto, una medida de control esencial para una replicación precisa. La filtración de muestras o diluyentes tampoco se informa rutinariamente, y si es así, rara vez se incluyen los detalles del filtro (fabricante, material de membrana, tamaño de poro) y las condiciones de almacenamiento. Los estándares mínimos de detalle experimental aceptable de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) deben incluir un protocolo NTA bien documentado para la caracterización de EV. El siguiente experimento proporciona evidencia de que el investigador individual debe establecer un protocolo de análisis NTA e incluirlo en los métodos de publicaciones que utilizan la caracterización NTA como una de las opciones para cumplir con los requisitos MISEV2018 para la caracterización de una sola vesícula.

Introduction

El análisis preciso y repetible de vehículos eléctricos y otras partículas a escala nanométrica presenta numerosos desafíos en toda la investigación y la industria. La replicación de la investigación ev ha sido difícil, en parte, debido a la falta de uniformidad en el informe de los parámetros necesarios asociados con la recopilación de datos. Para abordar estas deficiencias, el ISEV propuso pautas de la industria como un conjunto mínimo de estándares bioquímicos, biofísicos y funcionales para los investigadores de vehículos eléctricos y los publicó como una declaración de posición, comúnmente conocida como MISEV2014¹. El ritmo acelerado de la investigación de vehículos eléctricos requirió una guía actualizada, y la “MISEV2018: una declaración de posición del ISEV” amplió las directrices MISEV2014². El documento MISEV2018 incluyó tablas, esquemas de protocolos sugeridos y pasos a seguir para documentar la caracterización específica asociada a EV. Como medida adicional para facilitar la interpretación y replicación de los experimentos, EV-TRACK se desarrolló como una base de conocimientos de crowdsourcing (http://evtrack.org) para permitir informes más transparentes de la biología de ev y la metodología utilizada para los resultados publicados³. A pesar de estas recomendaciones para la presentación de informes estandarizados de métodos, el campo continúa sufriendo con respecto a la replicación y confirmación de los resultados publicados.

Encajando con el esfuerzo de los Institutos Nacionales de Salud y la Fundación Nacional de Ciencias por las herramientas de evaluación de la calidad, este documento sugiere que ISEV requiere informes estandarizados de métodos y detalles para que las herramientas de evaluación de datos puedan aplicarse con el objetivo de replicar los resultados entre laboratorios. El informe de las fuentes celulares, los procedimientos de cultivo celular y los métodos de aislamiento de EV son factores importantes para definir las cualidades de la población de EV. Entre los instrumentos de NTA, factores como la configuración de detección, el índice de refracción del fluido portador, las poblaciones de partículas heterogéneas que contribuyen a la polidispersidad, la falta de requisitos de informes estandarizados y la ausencia de resultados de medición intra e interobservadores hacen que la comparación de NTA entre laboratorios sea difícil o imposible.

En uso desde 2006, NTA es un método popular para la determinación del tamaño y la concentración de nanopartículas que actualmente es utilizado por aproximadamente el 80% de los investigadores de EV⁴. Las Directrices MISEV2018 requieren dos formas de análisis de una sola vesícula, de las cuales NTA es una de las opciones populares. NTA sigue siendo de uso común para la caracterización de EV debido a su amplia accesibilidad, bajo costo por muestra y su teoría fundacional directa (la ecuación de Stokes-Einstein). La evaluación de EV por NTA genera una distribución del tamaño de partícula y una estimación de concentración utilizando la dispersión de luz láser y el análisis de movimiento browniano, con el límite inferior de detección determinado por el índice de refracción del EV. Cuando se utiliza una muestra de fluido de viscosidad y temperatura conocidas, se rastrean las trayectorias de los evs para determinar su desplazamiento cuadrático medio en dos dimensiones. Esto permite calcular el coeficiente de difusión de partículas y convertirlo en un diámetro hidrodinámico equivalente a una esfera mediante una ecuación de Stokes-Einstein modificada ^5,6,7. El análisis de partícula a partícula de NTA tiene menos interferencia por aglomerados o partículas más grandes en una población heterogénea de EV que otros métodos de caracterización⁷. Mientras que unas pocas partículas más grandes tienen un impacto mínimo en la precisión del tamaño, la presencia de cantidades incluso diminutas de partículas grandes y de alta dispersión de la luz da como resultado una reducción notable en la detección de partículas más pequeñas debido a la reducción de la detección y el seguimiento de EV^{por software 8}. Como técnica de medición, generalmente se considera que el NTA no está sesgado hacia partículas más grandes o agregados de partículas, pero puede resolver poblaciones de múltiples tamaños a través del análisis de partículas individuales⁹. Debido al uso de la dispersión de la luz por partículas, una de las limitaciones del análisis NTA es que cualquier partícula como polvo, plástico o polvo con atributos de refracción y tamaño similares en comparación con los EV no se puede diferenciar de los EV reales por este método de caracterización.

El NanoSight LM10 (analizador de tamaño de nanopartículas) y LM14 (módulo láser) se han vendido desde 2006, y aunque se han desarrollado modelos más nuevos de este instrumento, este modelo en particular se encuentra en muchas instalaciones centrales y se considera un caballo de batalla confiable. Se necesita capacitación para optimizar adecuadamente la configuración de NTA para mediciones de alta resolución de tamaño y concentración. Los dos ajustes importantes necesarios para una grabación de vídeo óptima son (1) el nivel de la cámara y (2) el umbral de detección. Estos deben ser establecidos por el operador en función de las características de la muestra. Una de las principales limitaciones del análisis NTA es la recomendación de concentraciones de muestra entre 10⁷ y 10⁹ partículas/ml, para lograr esta dilución de la muestra puede ser necesaria¹⁰. Las soluciones utilizadas para la dilución, como la solución salina tamponada con fosfato, la solución salina de 0,15 M o el agua ultrapura, rara vez están libres de partículas de menos de 220 μm de tamaño, lo que puede afectar las mediciones de NTA. La caracterización NTA de las soluciones utilizadas para la dilución debe realizarse al mismo nivel de cámara y umbral de detección que las muestras de nanopartículas que se están analizando. El tamaño y la concentración de nanopartículas presentes en los diluyentes utilizados para las diluciones de muestras de EV rara vez se incluyen en publicaciones que involucran el análisis NTA de EV.

Este protocolo utiliza el análisis NTA de liposomas sintéticos similares a EV evaluados utilizando niveles de cámara seleccionados, umbrales de detección y filtrado mecánico de las muestras para analizar los efectos sistemáticos del nivel de la cámara, el umbral de detección o la filtración de muestras en el conjunto de datos NTA. Los liposomas se sintetizaron como se describe en el Archivo Suplementario S1. Los liposomas sintéticos se utilizaron en este experimento debido a su uniformidad de tamaño, características físicas y estabilidad en el almacenamiento a 4 ° C. Aunque se podrían haber utilizado muestras reales de EV, la heterogenicidad y estabilidad de los EV durante el almacenamiento pueden haber complicado este estudio y su interpretación. Las similitudes en los informes de NTA de (A) liposomas y (B) EV indican que los efectos sistemáticos revelados para los liposomas en este documento probablemente también se aplicarán a la caracterización de EV (Figura 1). Juntos, estos hallazgos respaldan la noción de que el informe completo de la configuración crítica del software y la descripción del procesamiento de muestras, como el diluyente, la dilución y la filtración, afectan la reproducibilidad de los datos de NTA.

El propósito de este trabajo es demostrar que la variación de los ajustes de NTA (temperatura, nivel de cámara y umbral de detección) y la preparación de la muestra cambia los resultados recogidos: se obtuvieron diferencias sistemáticas y significativas en tamaño y concentración. Como NTA es una de las opciones populares para cumplir con la especificación de caracterización MISEV2018, estos resultados demuestran la importancia de informar la preparación de muestras y la configuración de NTA para garantizar la reproducibilidad.

Figura 1: Informes representativos de NTA para comparar liposomas con EV. (A) Liposomas: muestra sin filtrar caracterizada en NTA el 12 de marzo de 2020. (B) EV: muestra sin filtrar caracterizada en NTA el 26 de agosto de 2021. Abreviaturas: NTA = Análisis de seguimiento de nanopartículas; EV = vesículas extracelulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Directrices generales del protocolo Mantenga el microscopio en una mesa de aire o como mínimo en una mesa libre de vibraciones. Asegúrese de que las vibraciones extrañas (por ejemplo, golpes con los pies en el suelo, tocar la mesa, cierres de puertas, tráfico de laboratorio) se mantengan al mínimo. Ajuste y mantenga la temperatura del módulo láser a una temperatura constante para todas las grabaciones de video.NOTA: La temperatura elegida fue de 25 °C porque el analizad…

Representative Results

La Tabla 1 contiene los resultados de los videos NTA para las muestras de liposomas (18 filtradas y 18 sin filtrar) y un diluyente DPBS representativo. Las comparaciones entre los dos grupos se completaron independientemente del nivel de la cámara o el umbral de detección en este documento. Las muestras filtradas tenían un diámetro medio de partículas de 108,5 nm, un modo de partículas de 86,2 nm y una concentración de 7,4 × 108 partículas/ml. Por el contrario, las muestras sin filtra…

Discussion

Existen varios métodos disponibles para estimar el tamaño y la concentración de nanopartículas¹¹. Estos incluyen métodos de conjunto que generan una estimación del tamaño de una población, incluida la dispersión dinámica de la luz (DLS), la sedimentación centrífuga y el análisis a nivel de partícula única: microscopía electrónica, NTA, microscopía de fuerza atómica y detección de pulso resistivo sintonizable. De estos, DLS y NTA son métodos de medición de tamaño y concentrac…

Materials

Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container