Colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare per identificare metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con il recettore della tropomiosina chinasi B immobilizzato

Summary

Il protocollo descrive la preparazione di colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare (CMAC) con frammenti di membrana cellulare immobilizzata contenenti proteine B funzionali del recettore B della tropomiosina chinasi transmembrana. Viene inoltre spiegato l’uso di colonne CMAC nell’identificazione di metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con questi recettori e presenti in miscele naturali complesse.

Abstract

Le sostanze chimiche sintetizzate da piante, funghi, batteri e invertebrati marini sono state una ricca fonte di nuovi colpi di droga e piombo. Farmaci come statine, penicillina, paclitaxel, rapamicina o artemisinina, comunemente usati nella pratica medica, sono stati identificati e isolati per la prima volta dai prodotti naturali. Tuttavia, l’identificazione e l’isolamento di metaboliti specializzati biologicamente attivi da fonti naturali è un processo impegnativo e dispendioso in termini di tempo. Tradizionalmente, i singoli metaboliti vengono isolati e purificati da miscele complesse, in seguito all’estrazione della biomassa. Successivamente, le molecole isolate vengono testate in saggi funzionali per verificarne l’attività biologica. Qui presentiamo l’uso delle colonne di cromatografia di affinità di membrana cellulare (CMAC) per identificare composti biologicamente attivi direttamente da miscele complesse. Le colonne CMAC consentono l’identificazione di composti che interagiscono con proteine transmembrana funzionali immobilizzate (TMP) incorporate nel loro ambiente nativo di fosfolipidi a doppio strato. Si tratta di un approccio mirato, che richiede la conoscenza del TMP la cui attività si intende modulare con il candidato farmaco a piccola molecola appena identificato. In questo protocollo, presentiamo un approccio per preparare colonne CMAC con recettore immobilizzato della tropomiosina chinasi B (TrkB), che è emerso come un bersaglio praticabile per la scoperta di farmaci per numerosi disturbi del sistema nervoso. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per assemblare la colonna CMAC con recettori TrkB immobilizzati utilizzando linee cellulari di neuroblastoma che sovraesprimono i recettori TrkB. Presentiamo inoltre l’approccio per studiare la funzionalità della colonna e il suo utilizzo nell’identificazione di metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con i recettori TrkB.

Introduction

Le miscele botaniche sono ricche di composti farmacologicamente attivi¹, che fungono da buona fonte per l’identificazione di nuovi colpi di farmaci e conduce 2,3,4,5. La scoperta di nuovi farmaci da prodotti naturali è stato un approccio fruttuoso e molti farmaci attualmente approvati hanno avuto origine da composti identificati per la prima volta in natura. La diversità chimica dei composti naturali è difficile da eguagliare nelle librerie artificiali di molecole sintetizzate chimicamente. Molti composti naturali interagiscono e modulano bersagli proteici umani e possono essere considerati molecole simili a farmaci ottimizzate evolutivamente⁶. Questi composti naturali sono particolarmente adatti per l’identificazione del piombo farmacologico da utilizzare nei disturbi neurologici⁶. Due dei farmaci attualmente approvati dalla FDA per la gestione della malattia di Alzheimer (AD) sono derivati da alcaloidi naturali, vale a dire: galantamina e rivastigmina (un derivato della fisostigmina)⁶. L-DOPA, attualmente il farmaco più comunemente prescritto per il morbo di Parkinson, è stato identificato per la prima volta dalla fava (Vicia faba L.) ⁷. Pergolide e lisuride, agonisti del recettore dopaminergico sono i derivati degli alcaloidi naturali della segale cornuta dal fungo parassita Claviceps purpurea⁸. Reserpina, un alcaloide isolato dalla radice di serpente indiana (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) è stato uno dei primi farmaci antipsicotici⁹. Recentemente, la risposta immunitaria disregolata e l’infiammazione sistemica sono state collegate allo sviluppo di numerosi disturbi neurologici, come il disturbo depressivo maggiore o le malattie neurodegenerative¹⁰. Una dieta a base vegetale insieme ad altri interventi sullo stile di vita è stata trovata per migliorare le capacità cognitive e funzionali negli anziani ^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Alcune molecole elettrofile appartenenti a triterpeni e polifenoli sono state trovate per modulare le risposte infiammatorie sia in vitro che in vivo modelli¹². Ad esempio, i composti naturali contenenti α.β-insaturo carbonile (ad esempio, curcumina, cinnamaldeide) o gruppo isotiocianato (ad esempio, sulforafano) interferiscono con la dimerizzazione del recettore Toll-like-4 (TLR4) inibendo la sintesi a valle di citochine pro-infiammatorie in una linea cellulare pro-B murina interleuchina-3 dipendente^12,22 . Le evidenze epidemiologiche indicano fortemente che i fitochimici dietetici, presenti in matrici alimentari complesse, possono anche costituire una valida fonte di nuovi lead farmacologici⁶.

Uno dei maggiori ostacoli nell’identificazione di molecole biologicamente attive presenti negli estratti vegetali, compresi gli alimenti a base vegetale, è la complessità dei campioni indagati. Tradizionalmente, i singoli composti vengono isolati, purificati e successivamente testati per l’attività biologica. Questo approccio di solito porta all’identificazione dei composti più abbondanti e ben caratterizzati. Gli approcci fenotipici alla scoperta di farmaci senza un bersaglio molecolare definito si basano sul frazionamento bioguidato di miscele complesse²³. In questo approccio, un estratto viene frazionato in sottofrazioni meno complesse che vengono successivamente testate in saggi fenotipici. L’isolamento e la purificazione dei composti attivi sono guidati dall’attività biologica verificata nel test. La conoscenza dell’identità di un bersaglio farmacologico specifico può accelerare significativamente l’identificazione di composti farmacologicamente attivi presenti in miscele complesse. Questi approcci sono solitamente basati sull’immobilizzazione del bersaglio molecolare, ad esempio un enzima, su una superficie solida, come le perle magnetiche²³. I bersagli immobilizzati vengono successivamente utilizzati negli esperimenti di screening con conseguente isolamento di composti che interagiscono con il bersaglio. Mentre questo approccio è stato ampiamente utilizzato nell’identificazione di composti mirati alle proteine citosoliche, è stato applicato meno comunemente nell’identificazione di sostanze chimiche che interagiscono con le proteine transmembrana (TMP)²³. Un’ulteriore sfida nell’immobilizzazione dei TMP deriva dal fatto che l’attività della proteina dipende dalla sua interazione con i fosfolipidi della membrana cellulare e altre molecole nel doppio strato come il colesterolo^23,24. È importante preservare queste sottili interazioni tra le proteine e il loro ambiente nativo fosfolipidico a doppio strato quando si tenta di immobilizzare il bersaglio transmembrana.

Nella cromatografia di affinità di membrana cellulare (CMAC) i frammenti di membrana cellulare, e non le proteine purificate, sono immobilizzati sulla membrana artificiale (IAM) particelle di fase stazionaria²³. Le fasi stazionarie IAM sono preparate legando covalentemente gli analoghi della fosfatidilcolina sulla silice. Recentemente sono state sviluppate nuove classi di fasi stazionarie IAM in cui i gruppi di ammine e silanoli liberi sono end-capped (IAM. PC. Particelle DD2). Durante la preparazione delle colonne CMAC i frammenti di membrana cellulare vengono immobilizzati sulla superficie delle particelle IAM attraverso l’adsorbimento.

Le colonne CMAC sono state utilizzate fino ad oggi per immobilizzare diverse classi di TMP, inclusi i canali ionici (ad esempio, recettori nicotinici), GPCR (ad esempio, recettori oppioidi), trasportatori di proteine (ad esempio, p-glicoproteina), ^ecc.24. I bersagli proteici immobilizzati sono stati utilizzati nella caratterizzazione della farmacodinamica (ad esempio, costante di dissociazione, Kd) o nella determinazione della cinetica di legame (k_on e k_off) di ligandi di piccole molecole che interagiscono con il bersaglio, nonché nel processo di identificazione di potenziali nuovi lead farmacologici presenti in matrici complesse²⁴ . Qui presentiamo la preparazione di colonne CMAC con il recettore immobilizzato della tropomiosina chinasi B (TrkB), che è emerso come un bersaglio praticabile per la scoperta di farmaci per numerosi disturbi del sistema nervoso.

Studi precedenti hanno dimostrato che l’attivazione del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)/TrkB è associata al miglioramento di alcuni disturbi neurologici, come l’AD o il disturbo depressivo maggiore 25,26,27,28. È stato riportato che i livelli di BDNF e il suo recettore TrkB di espressione diminuiscono nell’AD e riduzioni simili compromettono la funzione dell’ippocampo in modelli animali di AD²⁹. Livelli ridotti di BDNF sono stati riportati nel siero e nel cervello dei pazienti con AD 30,31,32. La sovraespressione di Tau o l’iperfosforilazione sono state trovate per down-regolare l’espressione di BDNF nei neuroni primari e modelli animali di AD ^33,34,35. Inoltre, è stato segnalato che il BDNF ha effetti protettivi sulla neurotossicità indotta da β-amiloide in vitro e in vivo³⁶. La somministrazione diretta di BDNF nel cervello del ratto ha dimostrato di aumentare l’apprendimento e la memoria negli animali cognitivamente compromessi³⁷. BDNF / TrkB è emerso come un obiettivo valido per migliorare i disturbi neurologici e psichiatrici tra cui AD^28,38. Prendere di mira la via di segnalazione BDNF / TrkB per lo sviluppo di terapie nell’AD migliorerà potenzialmente la nostra comprensione della malattia³⁹. Sfortunatamente, il BDNF stesso non può essere usato come trattamento a causa delle sue scarse proprietà farmacocinetiche e degli effetti collaterali avversi⁴⁰. Gli attivatori di piccole molecole delle vie TrkB/BDNF sono stati esplorati come potenziali ligandi TrkB 41,42,43. Tra gli agonisti di piccole molecole testati, il 7,8-diidrossiflavone (7,8-DHF), ha dimostrato di attivare la via BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un derivato del 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromone-7,8-diil bis(metilcarbammato)) è attualmente in esame come possibile farmaco per l’AD⁴⁷. Recentemente, è stato dimostrato che diversi antidepressivi agiscono attraverso il legame diretto al TrkB e la promozione della segnalazione BDNF, sottolineando ulteriormente l’importanza di perseguire TrkB come obiettivo valido per il trattamento di vari disturbi neurologici⁴⁸.

Il protocollo descrive il processo di assemblaggio della colonna TrkB funzionale e della colonna di controllo negativo TrkB-NULL. Le colonne sono caratterizzate utilizzando un noto prodotto naturale legante molecolare piccolo: 7,8-DHF. Inoltre, descriviamo il processo di screening di matrici complesse, utilizzando l’estratto vegetale come esempio, per l’identificazione di composti che interagiscono con TrkB.

Protocol

1. Coltura cellulare di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y (linee cellulari TrkB e TrkB-NULL (parentali)) NOTA: Le linee cellulari (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) e SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 sono state acquistate da Kerafast. Le cellule coltivate sono utilizzate come fonte dei recettori transmembrana da immobilizzare per la preparazione delle colonne CMAC. I seguenti passaggi descrivono come ottenere fram…

Representative Results

Seguendo il protocollo, sono state assemblate due colonne cromatografiche CMAC: una con i frammenti immobilizzati della membrana cellulare del neuroblastoma SH-SY5Y con TrkB sovraespresso e una con frammenti di membrana cellulare SH-SY5Y TrkB-NULL. La colonna CMAC correttamente assemblata è presentata in Figura 1 e le fasi coinvolte nell’immobilizzazione del frammento di membrana cellulare sono presentate in Figura 2. Dall’immobilizz…

Discussion

L’identificazione di composti attivi presenti in miscele complesse di metaboliti specializzati è un compito molto impegnativo²³. Tradizionalmente, i singoli composti sono isolati e la loro attività viene testata in diversi saggi. Questo approccio è dispendioso in termini di tempo e denaro e spesso porta all’isolamento e all’identificazione dei composti più abbondanti e ben caratterizzati²³. I saggi di screening ad alto rendimento attualmente utilizzati si basano fortem…

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon Plan Fluor	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA