Colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular para identificar metabólitos de plantas especializadas interagindo com tropomyosina quinase imobilizada receptor B

Summary

O protocolo descreve a preparação de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) com fragmentos de membrana celular imobilizada contendo proteínas funcionais do receptor B transmembrano. Também é explicado o uso de colunas CMAC na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com esses receptores e presentes em complexas misturas naturais.

Abstract

Produtos químicos sintetizados por plantas, fungos, bactérias e invertebrados marinhos têm sido uma rica fonte de novos hits e leads de drogas. Medicamentos como estatinas, penicilina, paclitaxel, rapamicina ou artemisina, comumente utilizados na prática médica, foram primeiramente identificados e isolados de produtos naturais. No entanto, a identificação e isolamento de metabólitos especializados biologicamente ativos de fontes naturais é um processo desafiador e demorado. Tradicionalmente, os metabólitos individuais são isolados e purificados a partir de misturas complexas, após a extração da biomassa. Posteriormente, as moléculas isoladas são testadas em ensaios funcionais para verificar sua atividade biológica. Aqui apresentamos o uso de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) para identificar compostos biologicamente ativos diretamente de misturas complexas. As colunas CMAC permitem a identificação de compostos interagindo com proteínas transmembrana funcionais imobilizadas (TMPs) incorporadas em seu ambiente bicamador nativo fosfolipídico. Trata-se de uma abordagem direcionada, que requer conhecer o TMP cuja atividade se pretende modular com o recém-identificado candidato a pequenas moléculas. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem para preparar colunas CMAC com tropomyosina quinase imobilizada receptor B (TrkB), que emergiu como um alvo viável para a descoberta de drogas para numerosos distúrbios do sistema nervoso. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para montar a coluna CMAC com receptores TrkB imobilizados usando linhas celulares neuroblastoma superexpressando receptores TrkB. Apresentamos ainda a abordagem para investigar a funcionalidade da coluna e seu uso na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com receptores TrkB.

Introduction

As misturas botânicas são ricas em compostos farmacologicamente ativos¹, servindo como uma boa fonte para a identificação de novos hits de drogas e leva 2,3,4,5. A descoberta de novos medicamentos a partir de produtos naturais tem sido uma abordagem frutífera e muitos medicamentos atualmente aprovados originaram-se de compostos identificados pela primeira vez na natureza. A diversidade química de compostos naturais é difícil de ser comparada por bibliotecas feitas pelo homem de moléculas quimicamente sintetizadas. Muitos compostos naturais interagem e modulam alvos de proteína humana e podem ser considerados moléculas evolutivamente otimizadas como drogas⁶. Estes compostos naturais são particularmente adequados para a identificação de chumbo de drogas para uso em distúrbios neurológicos⁶. Dois dos medicamentos atualmente aprovados pela FDA para o manejo da doença de Alzheimer (DA) são derivados de alcaloides naturais, a ver: galantamina e rivastigmina (um derivado da fisstigmina)⁶. L-DOPA, atualmente o medicamento mais comumente prescrito para doença de Parkinson, foi identificado pela primeira vez a partir do feijão largo (Vicia faba L.) ⁷. Pergolida e lisúride, agonistas receptores dopaminérgicos são os derivados de alcaloides naturais do fungo parasita Claviceps purpurea⁸. Reserpine, um alcaloide isolado da raiz de cobra indiana (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) foi uma das primeiras drogas antipsicóticas⁹. Recentemente, a resposta imune disregulada e a inflamação sistêmica têm sido ligadas ao desenvolvimento de inúmeras doenças neurológicas, como transtorno depressivo grave ou doenças neurodegenerativas¹⁰. Uma dieta à base de plantas, juntamente com outras intervenções de estilo de vida, tem sido encontrada para melhorar as habilidades cognitivas e funcionais em idosos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Algumas moléculas eletrofílicas pertencentes a triterpenos e polifenóis foram encontradas para modular respostas inflamatórias nos modelos in vitro e in vivo ¹². Por exemplo, compostos naturais contendo carbonilo α.β insaturados (por exemplo, curcumina, cinnamaldeído), ou grupo isothiocyanato (por exemplo, sulforaphane) interfere com a dimerização do receptor-4 (TLR4) que inibe a síntese a jusante de citocinas pró-inflamatórias em uma linha de células pró-B dependentes^de maça . Evidências epidemiológicas apontam fortemente que fitoquímicos dietéticos, presentes em matrizes alimentares complexas, também podem constituir uma fonte viável de novas drogas leva⁶.

Um dos principais obstáculos na identificação de moléculas biologicamente ativas presentes nos extratos vegetais, incluindo alimentos à base de plantas, é a complexidade das amostras investigadas. Tradicionalmente, os compostos individuais são isolados, purificados e posteriormente testados para atividade biológica. Essa abordagem geralmente leva à identificação dos compostos mais abundantes e bem caracterizados. A descoberta de drogas fenotípicas se aproxima sem um alvo molecular definido, depende do fracionamento bioguisticuto de misturas complexas²³. Nesta abordagem, um extrato é fracionado em sub frações menos complexas que são posteriormente testadas em ensaios fenotípicos. O isolamento e purificação dos compostos ativos são orientados pela atividade biológica verificada no ensaio. O conhecimento da identidade de um alvo de drogas especificado pode acelerar significativamente a identificação de compostos farmacologicamente ativos presentes em misturas complexas. Essas abordagens são geralmente baseadas na imobilização do alvo molecular, por exemplo, uma enzima, em uma superfície sólida, como as contas magnéticas²³. Os alvos imobilizados são posteriormente usados nos experimentos de triagem, resultando no isolamento de compostos interagindo com o alvo. Embora essa abordagem tenha sido amplamente utilizada na identificação de compostos voltados para proteínas citosóicas, tem sido menos comumente aplicada na identificação de produtos químicos interagindo com proteínas transmembranas (TMPs)²³. Um desafio adicional na imobilização dos TMPs decorre do fato de que a atividade da proteína depende de sua interação com fosfolipídios de membrana celular e outras moléculas na bicamada, como o colesterol ^23,24. É importante preservar essas interações sutis entre proteínas e seu ambiente bicamfato fosfolipídico nativo ao tentar imobilizar o alvo transmembrano.

Na membrana celular a cromatografia de afinidade de membrana (CMAC) fragmentos de membrana celular, e não proteínas purificadas, são imobilizados nas partículas de fase estacionárias da membrana artificial (IAM)²³. As fases estacionárias do IAM são preparadas por análogos de fosfatialina em sílica. Recentemente, novas classes de fases estacionárias do IAM foram desenvolvidas nas quais grupos gratuitos de amina e silanol são end-capped (IAM. Computador pessoal. Partículas DD2). Durante as colunas CMAC, fragmentos de membrana celular de preparação são imobilizados na superfície das partículas IAM através de adsorção.

As colunas CMAC têm sido usadas até o momento para imobilizar diferentes classes de TMPs, incluindo canais de íons (por exemplo, receptores nicotínicos), GPCRs (por exemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por exemplo, p-glicoproteína), ^etc.24. Os alvos de proteína imobilizada têm sido utilizados na caracterização da farmacodinâmica (por exemplo, constante de dissociação, Kd) ou determinando cinética de ligação (k_on e k_off) de ligantes de moléculas pequenas interagindo com o alvo, bem como no processo de identificação de potenciais novos cabos de droga presentes em matrizes complexas²⁴ . Aqui apresentamos a preparação das colunas CMAC com o receptor de tropomyosina quinase B (TrkB) imobilizado, que emergiu como um alvo viável para a descoberta de drogas para numerosos distúrbios do sistema nervoso.

Estudos anteriores mostraram que a ativação do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)/TrkB está associada à melhora de certas doenças neurológicas, como DA ou transtorno depressivo grave 25,26,27,28. Foi relatado que os níveis de BDNF e sua expressão receptor TrkB diminuem em AD, e reduções semelhantes prejudicam a função hipocampal em modelos animais de AD²⁹. A diminuição dos níveis de BDNF foi relatada em soro e cérebro de pacientes com DA 30,31,32. A superexpressão de Tau ou hiperfosforilação foram encontradas para diminuir a expressão BDNF em neurônios primários e modelos animais AD 33,34,35. Além disso, foi relatado que o BDNF tem efeitos protetores na neurotoxicidade induzida por β amiloide in vitro e in vivo³⁶. A administração direta de BDNF no cérebro de rato mostrou-se aumentar o aprendizado e a memória em animais com deficiência cognitiva³⁷. BDNF/TrkB emergiu como um alvo válido para amenização de distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo^{28,38 d.C}. Direcionar o caminho de sinalização BDNF/TrkB para o desenvolvimento de terapias em DDa potencialmente melhorará nossa compreensão da doença³⁹. Infelizmente, o BDNF em si não pode ser usado como tratamento devido às suas más propriedades farmacocinéticas e aos efeitos colaterais adversos⁴⁰. Pequenos ativadores de moléculas de vias TrkB/BDNF foram explorados como potenciais ligantes TrkB 41,42,43. Entre os agonistas de pequenas moléculas testados, 7,8-dihidroxyflavone (7,8-DHF), foi mostrado para ativar a via BDNF/TrkB 41,44,45,46. Um derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromne-7,8-diyl bis (metilcarbamate)) está atualmente em consideração como uma possível droga para AD⁴⁷. Recentemente, foi demonstrado que vários antidepressivos trabalham diretamente ligados ao TrkB e promovendo a sinalização BDNF, enfatizando ainda mais a importância de perseguir o TrkB como um alvo válido para tratar vários distúrbios neurológicos⁴⁸.

O protocolo descreve o processo de montagem da coluna TrkB funcional e da coluna de controle negativo TrkB-NULL. As colunas são caracterizadas por um produto natural conhecido ligante molecular: 7,8-DHF. Além disso, descrevemos o processo de triagem de matrizes complexas, utilizando como exemplo o extrato vegetal, para a identificação de compostos interagindo com trkB.

Protocol

1. Cultura celular das células neuroblastoma SH-SY5Y (linhas celulares TrkB e TrkB-NULL (parental) ) NOTA: As linhas de celular (linha celular SH-SY5Y (TrkB, BR6) e a linha de células parentais SH-SY5Y (TrkB NULL))49,50 foram compradas da Kerafast. As células cultivadas são usadas como fonte dos receptores transmembranos para serem imobilizadas para a preparação de colunas CMAC. As etapas a seguir descrevem como ob…

Representative Results

Seguindo o protocolo, foram montadas duas colunas cromatográficas CMAC: uma com fragmentos imobilizados de membrana celular neuroblastoma SH-SY5Y com TrkB superexpresso e outra com fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. A coluna CMAC corretamente montada é apresentada na Figura 1 e as etapas envolvidas na imobilização do fragmento de membrana celular são apresentadas na Figura 2. Desde a imobilização dos receptores T…

Discussion

A identificação de compostos ativos presentes em misturas complexas de metabólitos especializados é uma tarefa muito desafiadora²³. Tradicionalmente, compostos individuais são isolados, e sua atividade é testada em diferentes ensaios. Essa abordagem é demorada e cara e muitas vezes leva ao isolamento e identificação dos compostos mais abundantes e bem caracterizados²³. Atualmente, os ensaios de triagem de alto rendimento utilizados dependem fortemente da triagem d…

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon Plan Fluor	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA