Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Summary

Il protocollo descrive una semplice progettazione di chip microfluidici e una metodologia di microfabbricazione utilizzata per coltivare C. elegans in presenza di una fornitura continua di cibo fino a 36 ore. Il dispositivo di crescita e imaging consente inoltre l’imaging intermittente ad alta risoluzione a lungo termine dei processi cellulari e subcellulari durante lo sviluppo per diversi giorni.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha dimostrato di essere un valido sistema modello per lo studio dei processi biologici dello sviluppo e cellulare. La comprensione di questi processi biologici richiede spesso immagini a lungo termine e ripetute dello stesso animale. I lunghi tempi di recupero associati ai metodi di immobilizzazione convenzionali eseguiti su cuscinetti di agar hanno effetti dannosi sulla salute degli animali rendendo inappropriato visualizzare ripetutamente lo stesso animale per lunghi periodi di tempo. Questo articolo descrive la progettazione di chip microfluidici, il metodo di fabbricazione, il protocollo di coltura di C. elegans su chip e tre esempi di imaging a lungo termine per studiare i processi di sviluppo nei singoli animali. Il chip, fabbricato con polidimetilsilossano e legato su un vetro di copertura, immobilizza gli animali su un substrato di vetro utilizzando una membrana elastomerica che viene deviata usando azoto gassoso. L’immobilizzazione completa di C. elegans consente una solida imaging time-lapse di eventi cellulari e subcellulari in modo privo di anestesia. Una geometria del canale con un’ampia sezione trasversale consente all’animale di muoversi liberamente all’interno di due membrane di isolamento parzialmente sigillate che consentono la crescita nel canale con un continuo apporto di cibo. Utilizzando questo semplice chip, è possibile eseguire l’imaging di fenomeni di sviluppo come la crescita del processo neuronale, lo sviluppo vulvare e l’arborizzazione dendritica nei neuroni sensoriali PVD, mentre l’animale cresce all’interno del canale. Il chip di crescita e imaging a lungo termine funziona con una singola linea di pressione, senza valvole esterne, materiali di consumo fluidici economici e utilizza protocolli standard di gestione dei vermi che possono essere facilmente adattati da altri laboratori che utilizzano C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans ha dimostrato di essere un potente organismo modello per studiare la biologia cellulare, l’invecchiamento, la biologia dello sviluppo e la neurobiologia. Vantaggi come il suo corpo trasparente, il breve ciclo di vita, la facilità di manutenzione, un numero definito di cellule, l’omologia con diversi geni umani e la genetica ben studiata hanno portato C. elegans a diventare un modello popolare sia per le scoperte di biologia fondamentale che per la ricerca applicata ^1,2. Comprendere i processi biologici e di sviluppo delle cellule dall’osservazione ripetuta a lungo termine dei singoli animali può rivelarsi utile. Convenzionalmente, C. elegans viene anestetizzato su cuscinetti di agar e ripreso al microscopio. Gli effetti avversi degli anestetici sulla salute degli animali limitano l’uso di animali anestetizzati per l’imaging intermittente a lungo termine e ripetuto dello stesso animale ^3,4. I recenti progressi nelle tecnologie microfluidiche e il loro adattamento per l’intrappolamento senza anestesia di C. elegans con rischi trascurabili per la salute consentono l’imaging ad alta risoluzione dello stesso animale per un breve e lungo periodo di tempo.

I chip microfluidici sono stati progettati per lo screening ad alta produttività di C. elegans’5 ^6,7,8, l’intrappolamento e l’erogazione 9, lo screening farmacologico 10,11, la stimolazione neuronale con imaging ad alta risoluzione 12 e l’imaging ad alta risoluzione dell’animale ^12,13,14. Sono stati sviluppati anche fogli microfluidici ultrasottili per l’immobilizzazione su vetrini¹⁵. Studi a lungo termine su C. elegans sono stati condotti utilizzando immagini a bassa risoluzione di animali che crescono in coltura liquida per osservare la crescita, la dinamica del calcio, gli effetti dei farmaci sul loro comportamento^16,17,18,19, la loro longevità e l’invecchiamento²⁰. Sono stati condotti studi a lungo termine utilizzando microscopia ad alta risoluzione per valutare lo sviluppo sinaptico²¹, la rigenerazione neuronale 22 e l’aggiunta mitocondriale²³. L’imaging ad alta risoluzione a lungo termine e il tracciamento del destino cellulare e della differenziazione sono stati effettuati in dispositivi multicanale^24,25. Diversi eventi cellulari e subcellulari si verificano su scale temporali di diverse ore e richiedono l’intrappolamento dello stesso individuo in diversi punti temporali durante il loro sviluppo per caratterizzare tutte le fasi intermedie del processo per comprendere le dinamiche cellulari in vivo. Per visualizzare il processo biologico come l’organogenesi, lo sviluppo neuronale e la migrazione cellulare, l’animale deve essere immobilizzato nello stesso orientamento in più punti temporali. Abbiamo precedentemente pubblicato un protocollo per l’imaging ad alta risoluzione di C. elegans per oltre 36 ore per determinare dove vengono aggiunti i mitocondri lungo i neuroni del recettore tattile (TRN)²³.

Questo documento fornisce un protocollo per stabilire una metodologia basata sulla microfluidica per l’imaging ripetuto ad alta risoluzione. Questo dispositivo, con un singolo canale di flusso, è più adatto per l’imaging ripetuto di un singolo animale per dispositivo. Per migliorare la produttività e l’immagine di molti animali contemporaneamente, è possibile collegare più dispositivi alla stessa linea di pressione, ma con connettori a tre vie separati che controllano un singolo animale in ciascun dispositivo. Il design è utile per studi che richiedono immagini time-lapse ad alta risoluzione come processi di sviluppo post-embrionali, migrazione cellulare, trasporto di organelli, studi di espressione genica, ecc. La tecnologia potrebbe essere limitante per alcune applicazioni come la durata della vita e gli studi sull’invecchiamento che richiedono una crescita parallela e l’imaging di molti animali in fase avanzata. L’elastomero di polidimetilsilossano (PDMS) è stato utilizzato per fabbricare questo dispositivo grazie alla sua biostabilità²⁶, biocompatibilità 27,28, permeabilità ai gas ^29,30 e modulo elastico sintonizzabile ³¹. Questo dispositivo a due strati consente la crescita di animali con alimentazione continua in un canale microfluidico e l’intrappolamento di singoli C. elegans tramite compressione a membrana PDMS utilizzando azoto gassoso. Questo dispositivo è un’estensione del dispositivo precedentemente pubblicato con il vantaggio di crescere e visualizzare lo stesso animale nel microcanale sotto una fornitura continua di cibo³. La rete aggiuntiva di membrane di isolamento e una membrana di intrappolamento larga 2 mm consentono un’immobilizzazione efficiente degli animali in via di sviluppo. Il dispositivo è stato utilizzato per osservare lo sviluppo neuronale, lo sviluppo vulvare e l’arborizzazione dendritica nei neuroni PVD sensoriali. Gli animali crescono senza effetti avversi sulla salute nel dispositivo e possono essere ripetutamente immobilizzati per facilitare l’imaging di eventi subcellulari nello stesso animale durante il suo sviluppo.

L’intero protocollo è diviso in cinque parti. La Parte 1 descrive la fabbricazione del dispositivo per il chip di crescita e imaging. La Parte 2 descrive come impostare un sistema di pressione per la deflessione della membrana PDMS per immobilizzare e isolare i singoli C. elegans. La Parte 3 descrive come sincronizzare C. elegans su una piastra NGM (nematode growth medium) per l’imaging del dispositivo. La Parte 4 descrive come caricare un singolo animale nel dispositivo e far crescere l’animale all’interno del dispositivo microfluidico per diversi giorni. La Parte 5 descrive come immobilizzare un singolo animale in più punti temporali, catturare immagini ad alta risoluzione utilizzando obiettivi diversi e analizzare le immagini utilizzando le Fiji.

Protocol

1. Fabbricazione di dispositivi di crescita e imaging Fabbricazione di stampi SU8Progettare i modelli 1 (strato di flusso) e 2 (strato di controllo) utilizzando forme rettangolari in un software di elaborazione testi (o un software CAD di progettazione assistita da computer) e stampare le fotomaschere con l’aiuto di un plotter laser con una dimensione minima di 8 μm su pellicola a base di poliestere (Figura 1). Tagliare i wafer di silicone in pe…

Representative Results

Caratterizzazione del dispositivo: Il dispositivo di crescita e imaging è costituito da due strati PDMS legati insieme (Figura 1) utilizzando legami plasmatici irreversibili. Lo strato di flusso (modello 1) che è lungo 10 mm e alto 40 μm o 80 μm ci consente di coltivare l’animale in coltura liquida (Figura 1A). Lo strato di cattura (modello 2) ha una membrana larga 2 mm (Figura 1B) per immobilizzare l’animale p…

Discussion

In questo articolo, è stato descritto un protocollo per la fabbricazione e l’uso di un semplice dispositivo microfluidico per la crescita di C. elegans con costante approvvigionamento di cibo e imaging ad alta risoluzione di un singolo animale durante il suo sviluppo. Questo processo di fabbricazione è semplice e può essere eseguito in un ambiente non sterile. Un ambiente privo di polvere è fondamentale durante le fasi di fabbricazione. La presenza di particelle di polvere porterebbe a un contatto improprio …

Materials

18 G needles	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	Gauge 18
3-way stopcock	Cole-Parmer	WW-30600-02	Masterflex fitting with luer lock
CCD camera	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
Circuit board film	Fine Line Imaging, Colorado, USA		The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven	Meta-Lab Scientific Industries, India	MSI-5
Coverslips	Blue stat microscopic cover glass		22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	440191
Hot plate	IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope	ZEISS	LSM 5 LIVE
Micropipette tips	Tarsons		0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas	Local Supplier	Commercial nitrogen gas	Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard curing solution	curing agent
Petri plates	Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-32G
Razor and blades	Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard 184 base	elastomer base
Silicon tubes	Fisher Scientific		Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer	University Wafer, MA, USA	[100] orientation, 4-inch diameter	Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater	SPS-Europe B.V., The Netherlands	SPIN 150
Spinning Disk microscope	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer	Microchem, MA, USA	SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	448931	Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp	Oriel Instruments, Bangalore, India		200 Watt and collimated UV light source
Volocity software	Perkin-Elmer		Image analysis