En enkel mikrofluidisk chip for langsiktig vekst og avbildning av Caenorhabditis elegans

Summary

Protokollen beskriver en enkel mikrofluidisk chipdesign og mikrofabrikasjonsmetodikk som brukes til å dyrke C. elegans i nærvær av kontinuerlig matforsyning i opptil 36 timer. Vekst- og bildebehandlingsenheten muliggjør også intermitterende langsiktig høyoppløselig avbildning av cellulære og subcellulære prosesser under utvikling i flere dager.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har vist seg å være et verdifullt modellsystem for å studere utviklings- og cellebiologiske prosesser. Å forstå disse biologiske prosessene krever ofte langsiktig og gjentatt avbildning av det samme dyret. Lang gjenopprettingstid forbundet med konvensjonelle immobiliseringsmetoder gjort på agarputer har skadelige effekter på dyrehelsen, noe som gjør det upassende å gjentatte ganger avbilde det samme dyret over lange perioder. Dette papiret beskriver en mikrofluidisk chipdesign, fabrikasjonsmetode, on-chip C. elegans dyrkingsprotokoll og tre eksempler på langsiktig bildebehandling for å studere utviklingsprosesser hos individuelle dyr. Brikken, produsert med polydimetylsiloksan og bundet på et dekselglass, immobiliserer dyr på et glasssubstrat ved hjelp av en elastomer membran som avbøyes ved hjelp av nitrogengass. Fullstendig immobilisering av C. elegans muliggjør robust time-lapse-avbildning av cellulære og subcellulære hendelser på en bedøvelsesfri måte. En kanalgeometri med stort tverrsnitt gjør at dyret kan bevege seg fritt innenfor to delvis forseglede isolasjonsmembraner som tillater vekst i kanalen med kontinuerlig matforsyning. Ved hjelp av denne enkle brikken kan avbildning av utviklingsfenomener som nevronprosessvekst, vulvalutvikling og dendritisk arborisering i PVD-sensoriske nevroner, etter hvert som dyret vokser inne i kanalen, utføres. Den langsiktige vekst- og bildebrikken opererer med en enkelt trykkledning, ingen eksterne ventiler, billige fluidiske forbruksvarer, og benytter standard ormhåndteringsprotokoller som enkelt kan tilpasses av andre laboratorier ved hjelp av C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans har vist seg å være en kraftig modellorganisme for å studere cellebiologi, aldring, utviklingsbiologi og nevrobiologi. Fordeler som gjennomsiktig kropp, kort livssyklus, enkelt vedlikehold, et definert antall celler, homologi med flere menneskelige gener og godt studert genetikk har ført til at C. elegans har blitt en populær modell både for grunnleggende biologiske funn og anvendt forskning ^1,2. Å forstå cellens biologiske og utviklingsprosesser fra gjentatt langsiktig observasjon av individuelle dyr kan vise seg å være gunstig. Konvensjonelt er C. elegans bedøvet på agarputer og avbildet under mikroskopet. Bivirkninger av anestetika på dyrs helse begrenser bruken av bedøvede dyr for langsiktig og gjentatt intermitterende avbildning av samme dyr ^3,4. Nylige fremskritt innen mikrofluidiske teknologier og deres tilpasning for bedøvelsesfri fangst av C. elegans med ubetydelige helsefarer muliggjør høyoppløselig avbildning av det samme dyret over kort og lang tid.

Mikrofluidiske chips er designet for C. elegans’5 høy gjennomstrømningsscreening ^6,7,8, fangst og dispensering⁹, narkotikascreening 10,11, nevronstimulering med høyoppløselig bildebehandling 12 og høyoppløselig avbildning av dyret ^12,13,14. Ultratynne mikrofluidiske ark for immobilisering på lysbilder er også utviklet¹⁵. Langsiktige studier av C. elegans har blitt utført ved hjelp av lavoppløselige bilder av dyr som vokser i flytende kultur for å observere vekst, kalsiumdynamikk, narkotikaeffekter på deres oppførsel^16,17,18,19, deres levetid og aldring²⁰. Langsiktige studier ved bruk av høyoppløselig mikroskopi har blitt utført for å vurdere synaptisk utvikling²¹, neuronal regenerering 22 og mitokondriell addisjon²³. Langsiktig høyoppløselig bildebehandling og sporing av celleskjebne og differensiering er gjort i flerkanalsenheter^24,25. Flere cellulære og subcellulære hendelser forekommer over tidsskalaene på flere timer og krever fangst av samme individ på forskjellige tidspunkter under utviklingen for å karakterisere alle mellomliggende trinn i prosessen for å forstå cellulær dynamikk in vivo. For å avbilde biologisk prosess som organogenese, nevronutvikling og cellemigrasjon, må dyret immobiliseres i samme retning på flere tidspunkter. Vi har tidligere publisert en protokoll for høyoppløselig avbildning av C. elegans i over 36 timer for å bestemme hvor mitokondrier tilsettes langs berøringsreseptorneuronene (TRN)²³.

Dette papiret gir en protokoll for å etablere en mikrofluidikkbasert metodikk for gjentatt høyoppløselig bildebehandling. Denne enheten, med en enkelt strømningskanal, er best egnet for gjentatt avbildning av et enkelt dyr per enhet. For å forbedre gjennomstrømningen og avbildet mange dyr samtidig, kan flere enheter kobles til samme trykkledning, men med separate treveiskontakter som styrer et enkelt dyr i hver enhet. Designet er nyttig for studier som krever høyoppløselige time-lapse-bilder som postembryonale utviklingsprosesser, cellemigrasjon, organell transport, genuttrykksstudier, etc. Teknologien kan være begrensende for noen applikasjoner som levetid og aldringsstudier som krever parallell vekst og avbildning av mange senfasedyr. Polydimetylsiloksan (PDMS) elastomer ble brukt til fremstilling av denne enheten på grunn av biostabilitet²⁶, biokompatibilitet 27,28, gasspermeablilitet ^29,30 og justerbar elastisk modul ³¹. Denne tolagsinnretningen tillater vekst av dyr med kontinuerlig matforsyning i en mikrofluidisk kanal og fangst av individuelle C. elegans via PDMS-membrankompresjon ved bruk av nitrogengass. Denne enheten er en utvidelse av den tidligere publiserte enheten med fordelen av å dyrke og avbilde det samme dyret i mikrokanalen under en kontinuerlig matforsyning³. Det ekstra isolasjonsmembrannettverket og en 2 mm bred fangstmembran muliggjør effektiv immobilisering av utviklende dyr. Enheten har blitt brukt til å observere nevronutvikling, vulvalutvikling og dendritisk arborisering i sensoriske PVD-nevroner. Dyrene vokser uten negative helseeffekter i enheten og kan gjentatte ganger immobiliseres for å lette avbildning av subcellulære hendelser i samme dyr under utviklingen.

Hele protokollen er delt inn i fem deler. Del 1 beskriver enhetsfabrikasjon for vekst- og bildebrikken. Del 2 beskriver hvordan man setter opp et trykksystem for PDMS-membranavbøyningen for å immobilisere og isolere individuelle C. eleganer. Del 3 beskriver hvordan du synkroniserer C. elegans på en nematode vekstmedium (NGM) plate for enhetsavbildning. Del 4 beskriver hvordan du laster et enkelt dyr i enheten og vokser dyret inne i mikrofluidisk enhet i flere dager. Del 5 beskriver hvordan man immobiliserer et enkelt dyr på flere tidspunkter, tar bilder med høy oppløsning ved hjelp av forskjellige mål, og analyserer bildene ved hjelp av Fiji.

Protocol

1. Fabrikasjon av vekst- og bildebehandlingsenhet SU8 mugg fabrikasjonDesign mønstre 1 (flytlag) og 2 (kontrolllag) ved hjelp av rektangulære former i et tekstbehandlingsprogram (eller en datamaskinstøttet design CAD-programvare) og skriv ut fotomaskene ved hjelp av en laserplotter med en minimum funksjonsstørrelse på 8 μm på polyesterbasert film (figur 1). Skjær silikonskiver i 2,5 cm × 2,5 cm stykker og rengjør dem med 20% KOH i 1 min…

Representative Results

Enhet karakterisering: Vekst- og bildebehandlingsenheten består av to PDMS-lag bundet sammen (figur 1) ved hjelp av irreversibel plasmabinding. Strømningslaget (mønster 1) som er 10 mm i lengde og 40 μm eller 80 μm i høyden gjør at vi kan dyrke dyret i flytende kultur (figur 1A). Fangstlaget (mønster 2) har en 2 mm bred membran (figur 1B) for immobilisering av dyret for høyoppløselig avbildning. Masken fo…

Discussion

I dette papiret er det beskrevet en protokoll for fremstilling og bruk av en enkel mikrofluidisk enhet for dyrking av C. elegans med konstant matforsyning og høyoppløselig avbildning av et enkelt dyr under utviklingen. Denne fabrikasjonsprosessen er enkel og kan gjøres i et ikke-sterilt miljø. Et støvfritt miljø er kritisk under fabrikasjonstrinn. Tilstedeværelsen av støvpartikler vil føre til feil kontakt mellom de to bindingsflatene, noe som resulterer i dårlig binding og lekkasje av enheten under h?…

Materials

18 G needles	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	Gauge 18
3-way stopcock	Cole-Parmer	WW-30600-02	Masterflex fitting with luer lock
CCD camera	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
Circuit board film	Fine Line Imaging, Colorado, USA		The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven	Meta-Lab Scientific Industries, India	MSI-5
Coverslips	Blue stat microscopic cover glass		22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	440191
Hot plate	IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope	ZEISS	LSM 5 LIVE
Micropipette tips	Tarsons		0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas	Local Supplier	Commercial nitrogen gas	Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard curing solution	curing agent
Petri plates	Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-32G
Razor and blades	Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base)	Dow Corning Corporation, MI, USA	Sylgard 184 base	elastomer base
Silicon tubes	Fisher Scientific		Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer	University Wafer, MA, USA	[100] orientation, 4-inch diameter	Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater	SPS-Europe B.V., The Netherlands	SPIN 150
Spinning Disk microscope	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer	Microchem, MA, USA	SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, India	448931	Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp	Oriel Instruments, Bangalore, India		200 Watt and collimated UV light source
Volocity software	Perkin-Elmer		Image analysis