Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans
Summary
El protocolo describe un diseño simple de chip microfluídico y una metodología de microfabricación utilizada para cultivar C. elegans en presencia de un suministro continuo de alimentos durante hasta 36 h. El dispositivo de crecimiento e imágenes también permite obtener imágenes intermitentes de alta resolución a largo plazo de procesos celulares y subcelulares durante el desarrollo durante varios días.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha demostrado ser un valioso sistema modelo para estudiar los procesos biológicos celulares y de desarrollo. La comprensión de estos procesos biológicos a menudo requiere imágenes a largo plazo y repetidas del mismo animal. Los largos tiempos de recuperación asociados con los métodos convencionales de inmovilización realizados en almohadillas de agar tienen efectos perjudiciales para la salud animal, por lo que es inapropiado obtener imágenes repetidas del mismo animal durante largos períodos de tiempo. Este documento describe un diseño de chip microfluídico, método de fabricación, protocolo de cultivo de C. elegans en chip y tres ejemplos de imágenes a largo plazo para estudiar los procesos de desarrollo en animales individuales. El chip, fabricado con polidimetilsiloxano y unido a un vidrio de cubierta, inmoviliza a los animales en un sustrato de vidrio utilizando una membrana elastomérica que se desvía con gas nitrógeno. La inmovilización completa de C. elegans permite obtener imágenes robustas de lapso de tiempo de eventos celulares y subcelulares sin anestesia. Una geometría de canal con una gran sección transversal permite al animal moverse libremente dentro de dos membranas de aislamiento parcialmente selladas que permiten el crecimiento en el canal con un suministro continuo de alimentos. Usando este simple chip, se pueden realizar imágenes de fenómenos de desarrollo como el crecimiento del proceso neuronal, el desarrollo vulvar y la arborización dendrítica en las neuronas sensoriales PVD, a medida que el animal crece dentro del canal. El chip de crecimiento e imágenes a largo plazo funciona con una sola línea de presión, sin válvulas externas, consumibles fluídicos de bajo costo y utiliza protocolos estándar de manejo de gusanos que pueden ser fácilmente adaptados por otros laboratorios que utilizan C. elegans.
Introduction
Caenorhabditis elegans ha demostrado ser un poderoso organismo modelo para estudiar la biología celular, el envejecimiento, la biología del desarrollo y la neurobiología. Ventajas como su cuerpo transparente, ciclo de vida corto, fácil mantenimiento, un número definido de células, homología con varios genes humanos y genética bien estudiada han llevado a C. elegans a convertirse en un modelo popular tanto para los descubrimientos de biología fundamental como para la investigación aplicada 1,2. Comprender los procesos biológicos y de desarrollo de las células a partir de la observación repetida a largo plazo de animales individuales puede resultar beneficioso. Convencionalmente, C. elegans se anestesia en almohadillas de agar y se obtiene una imagen bajo el microscopio. Los efectos adversos de los anestésicos sobre la salud de los animales limitan el uso de animales anestesiados para imágenes intermitentes repetidas y a largo plazo del mismo animal 3,4. Los avances recientes en las tecnologías microfluídicas y su adaptación para la captura sin anestesia de C. elegans con riesgos insignificantes para la salud permiten obtener imágenes de alta resolución del mismo animal durante un período de tiempo corto y largo.
Los chips microfluídicos han sido diseñados para C. elegans’5 cribado de alto rendimiento 6,7,8, captura y dispensación9, cribado de fármacos 10,11, estimulación neuronal con imágenes de alta resolución 12 e imágenes de alta resolución del animal 12,13,14. También se han desarrollado láminas microfluídicas ultrafinas para la inmovilización en portaobjetos15. Se han realizado estudios a largo plazo de C. elegans utilizando imágenes de baja resolución de animales que crecen en cultivo líquido para observar el crecimiento, la dinámica del calcio, los efectos de los medicamentos en su comportamiento16,17,18,19, su longevidad y el envejecimiento20. Se han realizado estudios a largo plazo con microscopía de alta resolución para evaluar el desarrollo sináptico21, la regeneración neuronal 22 y la adición mitocondrial23. Las imágenes de alta resolución a largo plazo y el rastreo del destino y la diferenciación celular se han realizado en dispositivos multicanal24,25. Varios eventos celulares y subcelulares ocurren en las escalas de tiempo de varias horas y requieren atrapar al mismo individuo en diferentes puntos de tiempo durante su desarrollo para caracterizar todos los pasos intermedios en el proceso para comprender la dinámica celular in vivo. Para obtener imágenes de procesos biológicos como la organogénesis, el desarrollo neuronal y la migración celular, el animal necesita ser inmovilizado en la misma orientación en múltiples puntos de tiempo. Anteriormente hemos publicado un protocolo para imágenes de alta resolución de C. elegans durante más de 36 h para determinar dónde se agregan las mitocondrias a lo largo de las neuronas receptoras del tacto (TRN)23.
Este documento proporciona un protocolo para establecer una metodología basada en microfluídica para imágenes repetidas de alta resolución. Este dispositivo, con un solo canal de flujo, es el más adecuado para imágenes repetidas de un solo animal por dispositivo. Para mejorar el rendimiento y la imagen de muchos animales a la vez, se pueden conectar múltiples dispositivos a la misma línea de presión pero con conectores separados de tres vías que controlan un solo animal en cada dispositivo. El diseño es útil para estudios que exigen imágenes de lapso de tiempo de alta resolución, como procesos de desarrollo postembrionario, migración celular, transporte de orgánulos, estudios de expresión génica, etc. La tecnología podría ser limitante para algunas aplicaciones, como la vida útil y los estudios de envejecimiento que requieren crecimiento paralelo e imágenes de muchos animales en etapa tardía. El elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) se utilizó para fabricar este dispositivo debido a su bioestabilidad26, biocompatibilidad 27,28, permeabilidad al gas 29,30 y módulo elástico sintonizable 31. Este dispositivo de dos capas permite el crecimiento de animales con suministro continuo de alimentos en un canal microfluídico y la captura de C. elegans individuales a través de la compresión de membrana PDMS utilizando gas nitrógeno. Este dispositivo es una extensión del dispositivo publicado anteriormente con la ventaja de crecer e imaginar el mismo animal en el microcanal bajo un suministro continuo de alimentos3. La red de membranas de aislamiento adicional y una membrana de captura de 2 mm de ancho permiten la inmovilización eficiente de los animales en desarrollo. El dispositivo se ha utilizado para observar el desarrollo neuronal, el desarrollo vulvar y la arborización dendrítica en neuronas PVD sensoriales. Los animales crecen sin efectos adversos para la salud en el dispositivo y pueden inmovilizarse repetidamente para facilitar la obtención de imágenes de eventos subcelulares en el mismo animal durante su desarrollo.
Todo el protocolo se divide en cinco partes. La Parte 1 describe la fabricación del dispositivo para el chip de crecimiento e imagen. La Parte 2 describe cómo configurar un sistema de presión para la deflexión de la membrana PDMS para inmovilizar y aislar C. elegans individuales. La Parte 3 describe cómo sincronizar C. elegans en una placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) para obtener imágenes del dispositivo. La Parte 4 describe cómo cargar un solo animal en el dispositivo y hacer crecer al animal dentro del dispositivo microfluídico durante varios días. La Parte 5 describe cómo inmovilizar a un animal individual en múltiples puntos de tiempo, capturar imágenes de alta resolución utilizando diferentes objetivos y analizar las imágenes usando Fiji.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, se ha descrito un protocolo para la fabricación y el uso de un dispositivo microfluídico simple para el cultivo de C. elegans con suministro constante de alimentos e imágenes de alta resolución de un solo animal durante su desarrollo. Este proceso de fabricación es simple y se puede hacer en un ambiente no estéril. Un entorno libre de polvo es crítico durante los pasos de fabricación. La presencia de partículas de polvo conduciría a un contacto inadecuado entre las dos superficies de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la instalación de imágenes CIFF, NCBS por el uso de los microscopios confocales apoyados por el DST – Centro de Nanotecnología (No. SR/55/NM-36-2005). Agradecemos la financiación de la investigación de DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), disco giratorio apoyado por DAE-PRISM 12-R & D-IMS-5.02.0202 (SPK y Gautam Menon), y HHMI-IECS número de subvención 55007425 (SPK). Las cepas HB101, PS3239 y wdIs51 fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). S.P.K. hizo jsIs609 en el laboratorio de Mike Nonet.
Materials
| 18 G needles | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | Gauge 18 | |
| 3-way stopcock | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex fitting with luer lock |
| CCD camera | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| Circuit board film | Fine Line Imaging, Colorado, USA | The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI) | |
| Convection Oven | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| Coverslips | Blue stat microscopic cover glass | 22mm x 10Gms | |
| Ethanol | Hi media | ||
| Harris uni-core puncher 1mm | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| Hot plate | IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| Laser Scanning Microscope | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette tips | Tarsons | 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply | |
| Negative Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Negative Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Nitrogen gas | Local Supplier | Commercial nitrogen gas | Cylinder volume of 7 cubic meter |
| PDMS (Curing solution) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard curing solution | curing agent |
| Petri plates | Praveen Scientific Corporation | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| Razor and blades | Lister surgical Blade | ||
| Silicon Elastomer (Base) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 base | elastomer base |
| Silicon tubes | Fisher Scientific | Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm | |
| Silicon wafer | University Wafer, MA, USA | [100] orientation, 4-inch diameter | Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer |
| Spin Coater | SPS-Europe B.V., The Netherlands | SPIN 150 | |
| Spinning Disk microscope | Perkin Elmer ultra-view VOX system | CSU-X1-A3 N | The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package. |
| SU8 developer | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic |
| UV lamp | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 Watt and collimated UV light source | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Image analysis |
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