JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Bioingegneria

En simpel mikrofluidisk chip til langsigtet vækst og billeddannelse af Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022
doi:
10.3791/63136
, ,
1National Centre for Biological Sciences,TIFR, 2Department of Biological Sciences,TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering,The University of Texas at Austin

Summary

Protokollen beskriver et simpelt mikrofluidisk chipdesign og mikrofabrikationsmetode, der bruges til at dyrke C. elegans i nærvær af en kontinuerlig fødevareforsyning i op til 36 timer. Vækst- og billeddannelsesenheden muliggør også intermitterende langsigtet højopløsningsbilleddannelse af cellulære og subcellulære processer under udvikling i flere dage.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har vist sig at være et værdifuldt modelsystem til undersøgelse af udviklings- og cellebiologiske processer. At forstå disse biologiske processer kræver ofte langvarig og gentagen billeddannelse af det samme dyr. Lange restitutionstider forbundet med konventionelle immobiliseringsmetoder udført på agarpuder har skadelige virkninger på dyresundheden, hvilket gør det upassende at gentagne gange forestille sig det samme dyr over lange perioder. Dette papir beskriver et mikrofluidisk chipdesign, fremstillingsmetode, on-chip C. elegans dyrkningsprotokol og tre eksempler på langsigtet billeddannelse for at studere udviklingsprocesser hos individuelle dyr. Chippen, fremstillet med polydimethylsiloxan og bundet på et dækglas, immobiliserer dyr på et glassubstrat ved hjælp af en elastomerisk membran, der afbøjes ved hjælp af nitrogengas. Komplet immobilisering af C. elegans muliggør robust time-lapse-billeddannelse af cellulære og subcellulære hændelser på en bedøvelsesfri måde. En kanalgeometri med et stort tværsnit gør det muligt for dyret at bevæge sig frit inden for to delvist forseglede isolationsmembraner, der tillader vækst i kanalen med en kontinuerlig fødevareforsyning. Ved hjælp af denne enkle chip kan billeddannelse af udviklingsfænomener som neuronal procesvækst, vulvaludvikling og dendritisk arborisering i PVD-sensoriske neuroner, når dyret vokser inde i kanalen, udføres. Den langsigtede vækst- og billedbehandlingschip fungerer med en enkelt trykledning, ingen eksterne ventiler, billige fluidiske forbrugsstoffer og bruger standard ormhåndteringsprotokoller, der let kan tilpasses af andre laboratorier ved hjælp af C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans har vist sig at være en stærk modelorganisme til at studere cellebiologi, aldring, udviklingsbiologi og neurobiologi. Fordele som dens gennemsigtige krop, korte livscyklus, nem vedligeholdelse, et defineret antal celler, homologi med flere menneskelige gener og velundersøgt genetik har ført til, at C. elegans er blevet en populær model både for grundlæggende biologiske opdagelser og anvendt forskning 1,2. At forstå cellens biologiske og udviklingsmæssige processer fra gentagen langtidsobservation af individuelle dyr kan vise sig at være gavnligt. Konventionelt bedøves C. elegans på agarpuder og afbildes under mikroskopet. Anæstetikas skadelige virkninger på dyrs sundhed begrænser brugen af bedøvede dyr til langvarig og gentagen intermitterende billeddannelse af det samme dyr 3,4. De seneste fremskridt inden for mikrofluidiske teknologier og deres tilpasning til bedøvelsesfri fældefangst af C. elegans med ubetydelige sundhedsfarer muliggør billeddannelse i høj opløsning af det samme dyr over en kort og lang periode.

Mikrofluidiske chips er designet til C. elegans’5 high throughput screening 6,7,8, trapping og dispensering 9, drug screening 10,11, neuron stimulering med høj opløsning billeddannelse 12, og høj opløsning billeddannelse af dyret12,13,14. Ultratynde mikrofluidiske ark til immobilisering på dias er også blevet udviklet15. Langsigtede undersøgelser af C. elegans er blevet udført ved hjælp af lavopløsningsbilleder af dyr, der vokser i flydende kultur for at observere vækst, calciumdynamik, lægemiddeleffekter på deres adfærd16,17,18,19, deres levetid og aldring20. Langtidsundersøgelser med mikroskopi med høj opløsning er blevet udført for at vurdere synaptisk udvikling21, neuronal regenerering 22 og mitokondrietilsætning23. Langsigtet højopløsningsbilleddannelse og sporing af celleskæbne og differentiering er blevet udført i multikanalsenheder24,25. Flere cellulære og subcellulære hændelser forekommer over tidsskalaer på flere timer og kræver fangst af det samme individ på forskellige tidspunkter under deres udvikling for at karakterisere alle mellemliggende trin i processen for at forstå cellulær dynamik in vivo. For at afbilde biologisk proces som organogenese, neuronal udvikling og cellemigration skal dyret immobiliseres i samme orientering på flere tidspunkter. Vi har tidligere offentliggjort en protokol for højopløsningsbilleddannelse af C. elegans i over 36 timer for at bestemme, hvor mitokondrier tilsættes langs berøringsreceptorneuronerne (TRN’er)23.

Dette papir indeholder en protokol til etablering af en mikrofluidikbaseret metode til gentagen billeddannelse i høj opløsning. Denne enhed med en enkelt flowkanal er bedst egnet til gentagen billeddannelse af et enkelt dyr pr. Enhed. For at forbedre gennemstrømningen og afbilde mange dyr på én gang kan flere enheder tilsluttes den samme trykledning, men med separate trevejsstik, der styrer et enkelt dyr i hver enhed. Designet er nyttigt til undersøgelser, der kræver time-lapse-billeder i høj opløsning, såsom postembryonale udviklingsprocesser, cellemigration, organelletransport, genekspressionsundersøgelser osv. Teknologien kan være begrænsende for nogle applikationer såsom levetid og aldringsundersøgelser, der kræver parallel vækst og billeddannelse af mange dyr i sen fase. Polydimethylsiloxan (PDMS) elastomer blev brugt til fremstilling af denne enhed på grund af dens biostabilitet26, biokompatibilitet 27,28, gaspermeablilitet 29,30 og justerbar elastisk modul 31. Denne to-lags enhed tillader vækst af dyr med kontinuerlig fødeforsyning i en mikrofluidisk kanal og fangst af individuelle C. elegans via PDMS-membrankompression ved hjælp af nitrogengas. Denne enhed er en udvidelse af den tidligere offentliggjorte enhed med fordelen ved at dyrke og billeddanne det samme dyr i mikrokanalen under en kontinuerlig fødevareforsyning3. Det ekstra isolationsmembrannetværk og en 2 mm bred fangstmembran muliggør effektiv immobilisering af udviklende dyr. Enheden er blevet brugt til at observere neuronal udvikling, vulvaludvikling og dendritisk arborisering i sensoriske PVD-neuroner. Dyrene vokser uden sundhedsskadelige virkninger i enheden og kan gentagne gange immobiliseres for at lette billeddannelse af subcellulære hændelser i det samme dyr under dets udvikling.

Hele protokollen er opdelt i fem dele. Del 1 beskriver enhedsfremstilling til vækst- og billedchippen. Del 2 beskriver, hvordan man opretter et tryksystem til PDMS-membranafbøjningen for at immobilisere og isolere individuelle C. elegans. Del 3 beskriver, hvordan man synkroniserer C. elegans på en nematodevækstmedium (NGM) plade til enhedsbilleddannelse. Del 4 beskriver, hvordan man indlæser et enkelt dyr i enheden og dyrker dyret inde i den mikrofluidiske enhed i flere dage. Del 5 beskriver, hvordan man immobiliserer et enkelt dyr på flere tidspunkter, tager billeder i høj opløsning ved hjælp af forskellige mål og analyserer billederne ved hjælp af Fiji.

Protocol

1. Fremstilling af vækst- og billeddannelsesenhed SU8 fremstilling af skimmelsvampDesign mønstre 1 (flowlag) og 2 (kontrollag) ved hjælp af rektangulære former i en tekstbehandlingssoftware (eller en computerstøttet design CAD-software) og udskriv fotomaskerne ved hjælp af en laserplotter med en mindste funktionsstørrelse på 8 μm på polyesterbaseret film (figur 1). Skær siliciumskiver i stykker på 2,5 cm × 2,5 cm og rengør dem med 2…

Representative Results

Karakterisering af enhed: Vækst- og billeddannelsesenheden består af to PDMS-lag bundet sammen (figur 1) ved hjælp af irreversibel plasmabinding. Strømningslaget (mønster 1), som er 10 mm langt og 40 μm eller 80 μm i højden, giver os mulighed for at dyrke dyret i flydende kultur (figur 1A). Fældelaget (mønster 2) har en 2 mm bred membran (figur 1B) til immobilisering af dyret til billeddannelse i høj opl…

Discussion

I dette papir er en protokol til fremstilling og brug af en simpel mikrofluidisk enhed til dyrkning af C. elegans med konstant fødevareforsyning og højopløsningsbilleddannelse af et enkelt dyr under dets udvikling blevet beskrevet. Denne fremstillingsproces er enkel og kan udføres i et ikke-sterilt miljø. Et støvfrit miljø er kritisk under fabrikationstrin. Tilstedeværelsen af støvpartikler ville føre til forkert kontakt mellem de to bindingsflader, hvilket resulterer i dårlig binding og lækage af en…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker CIFF imaging facility, NCBS for brug af de konfokale mikroskoper støttet af DST – Center for Nanoteknologi (nr. SR/55/NM-36-2005). Vi takker forskningsmidler fra DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), spinningskive understøttet af DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK og Gautam Menon) og HHMI-IECS-tilskudsnummer 55007425 (SPK). HB101, PS3239 og wdIs51 stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. lavede jsIs609 i Mike Nonets laboratorium.

Materials

18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Biologia dello sviluppo. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

Microfluidic ChipCaenorhabditis ElegansDevice FabricationFlow LayerControl LayerPhotoresistSpin CoatingUV ExposureSoft BakeDevice ReusabilityImagingLong-term Growth
check_url/it/63136?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image